[发明专利]一种单细胞基因组目标区域捕获的方法

说明书

本发明涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法。具体的通过对单细胞基因组进行全基因组扩增，对扩增后的基因组进行打断、末端修复、3'端加A、加接头、PCR扩增、目标区域捕获、对目标区域捕获的DNA片段进行PCR扩增及测序。通过本发明提供的方法可以提高捕获测序结果的覆盖度，提高捕获结果的特异性。

技术领域

本发明涉及一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，属于基因检测技术领域。

背景技术

单细胞测序在2011年被《Nature Methods》列为年度值得期待的技术之一，在2013年被《Science》列为年度最值得关注的六大领域榜首，其越来越受到科研工作者的青睐，相关的研究成果也井喷式地发表在各顶级期刊上，这些都表明，单细胞测序已逐渐成为科研热点。

单细胞测序技术可以剖析细胞的异质性，揭示肿瘤细胞基因组中发生的变异。有助于我们描述肿瘤细胞的克隆结构，并追踪疾病的进展和扩散范围。目前该技术已广泛地应用在辅助生殖、癌症、神经学和免疫学等领域。

单细胞目标区域捕获测序是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA进行扩增，获得高覆盖率的完整的基因组之后定制目标基因组区域的探针，与基因组DNA进行杂交，将目标区域DNA富集后进行高通量测序的技术手段。单细胞目标区域测序技术用于揭示细胞群体差异和细胞进化关系，也有助于发现和验证疾病特别是癌症的相关候选基因或相关位点，在临床诊断和药物开发方面有着巨大的应用潜力[1]。目标区域捕获测序的优势在于只对感兴趣的基因组区域进行研究，而且在获得相同数据量时测序深度更深，结果更准确；而且与常规基因组测序相比，其不仅费用较低，数据阐释也更为简单。

单细胞基因组目标区域捕获测序相较于正常样本(无需扩增基因组，基因组的量足够进行目标区域捕获测序的样本)基因组的目标区域捕获测序的效果还是有明显区别的。首先，单细胞基因组只有两个拷贝，总量约6pg。在扩增过程中，可能无法重现完整的基因组。其次，假如丢失的部分恰是芯片探针的区域，那么就会影响捕获特异性，造成数据量浪费。而且在相同测序深度下，单细胞目标区域捕获测序的靶区域覆盖度较普通基因组的要低。

参考文献

[1]Wang,Y.et al.Clonal evolution in breast cancer revealed by singlenucleus genome sequencing.Nature 512,155–160(2014).

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，通过优化全基因组扩增流程、文库构建流程以及目标区域捕获流程，从而提高捕获测序结果的覆盖度和捕获结果的特异性。

1.一种单细胞基因组目标区域捕获的方法，包括：

步骤A：采用多重置换扩增方法对单细胞基因组进行等温扩增，获得扩增后的基因组；

步骤B：取3μg扩增后的基因组进行打断，获得片段化的DNA片段；

步骤C：将片段化的DNA片段进行末端修复，获得平末端DNA片段；

步骤D：将平末端DNA片段进行3'端加A，获得3'端加A的DNA片段；

步骤E：将3'端加A的DNA片段进行加接头，获得加接头的DNA片段；

步骤F：将加接头的DNA片段进行PCR扩增，获得扩增的DNA片段；

步骤G：将扩增的DNA片段进行目标区域捕获，获得捕获的DNA片段；

步骤H：将捕获的DNA片段进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；

步骤I：将PCR扩增产物进行测序；

其中，所述步骤A中等温扩增的条件为30℃反应2小时；