[发明专利]一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测孔雀石绿的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、孔雀石绿标准品、孔雀石绿的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测孔雀石绿的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测孔雀石绿孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

背景技术

孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类工业染料，常用于制陶、纺织、皮革、食品颜色剂和细胞化学染色剂等。也可用作驱虫剂、杀虫剂、防腐剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。近年来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG)在水产动物体内有明显的蓄积残留现象，而其化学官能团三苯甲烷是一类致癌物质，食用经MG治疗的水产品后，免疫系统和繁殖系统受到较大的影响，具体地说是一种水产品中孔雀石绿快速定性的检测方法。

目前已发现可以致癌的化合物约有450余种，孔雀石绿，三苯甲烷类工业染料，是一种重要的化学致癌物，使用被其污染的水体，对人体健康有很大的威胁。测定食品及环境中孔雀石绿及其代谢物常用高效液相色谱法。采用二氧化铅衍生柱进行柱前或柱后氧化，将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿后进行检测驯；或者利用HPLC一荧光检测法直接检测鱼肉组织中的无色孔雀石绿。虽然这些方法的准确度较高，但仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高。为了确保动物食品安全，避免孔雀石绿对水生物及人体健康的危害，有必要建立对水产动物中孔雀石绿残留监测的灵敏、快速的分析方法。

而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对孔雀石绿孔雀石绿检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种水产品中孔雀石绿残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。

本发明的目的之二在于提供一种快速简便地检测水产品中孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测农作物中孔雀石绿残留量。

本发明目的之一是这样实现的：检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、孔雀石绿标准品溶液、抗孔雀石绿的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。

本发明目的之二是这样实现的：检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：

(1) 免疫原的制备：将半抗原孔雀石绿与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（孔雀石绿-BSA）；

(2) 包被原的制备：将半抗原孔雀石绿与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（孔雀石绿-OVA）；

(3) 单克隆抗体的制备：

a. 用步骤(1)的免疫原（孔雀石绿-BSA）免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗孔雀石绿的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

b. 以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗孔雀石绿的单克隆抗体IgG；

c. 用步骤(2)的包被原包被96孔包被板；

(4) 样品的前处理及检测：