[发明专利]一株产蛋白酶的菌株及其制备碱性蛋白酶的方法

权利要求书

1.一株产蛋白酶的菌株M-35，分类命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.），筛选于云南昆阳磷矿尾矿土壤，于2017年9月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.14618，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：

（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上28-32℃下培养22-26h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；

（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，25-30℃、180rpm摇床培养24～36h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；

（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K₂HPO₄ 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO₄ 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；

（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25-35℃，120rpm下摇床培养42-60h，得发酵碱性蛋白液；

（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的一株产蛋白酶的菌株M-35制备碱性蛋白酶的方法：其特征在于，包括以下步骤：

（1）、将菌株M-35置于斜面保藏培养基斜面上28℃下培养22h，菌丝长满后挑取菌株M-35接种于种子培养基中，所述的斜面保藏培养基为LB培养基，是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，琼脂15.0g和蒸馏水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；

（2）、将菌株M-35接种于种子培养基中，25℃、180rpm摇床培养24h，得到种子液；所述的种子培养基是由以下原料：蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g和水1000mL，pH=7.0，121℃灭菌20min制成；

（3）、配制发酵培养基：该培养基是由以下原料：黄豆粉10.0～15.0g，可溶性淀粉5.0～10.0g，乙酸钠2.0～5.0g，K₂HPO₄ 5.0～15.0g，KCl 0.2～0.5g，MnSO₄ 0.2～0.5g，Tween-800.2～0.5g和水1000mL，pH7.0，121℃灭菌20min制成；

（4）、接种：将种子液接种到发酵培养基中，种子液与发酵培养基的重量百分比为：种子液5-10%、培养基90-95%，25℃，120rpm下摇床培养60h，得发酵碱性蛋白液；

（5）、后处理：方法是：将发酵碱性蛋白酶液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80%硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH=7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，放入冷冻干燥机，在﹣45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。