[发明专利]重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种重组人源Ⅲ型胶原蛋白、表达菌株及其构建方法。所述的重组人源Ⅲ型胶原蛋白含有498个氨基酸，理论分子量约54.5kd，构建的重组人源Ⅲ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅲ型胶原蛋白。本发明的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，可以广泛应用于生物医用材料、化妆品等领域。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种重组人源III型胶原蛋白、表达重组人源III型胶原蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法。

背景技术

胶原(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白，约占蛋白总量的25～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。由于天然胶原蛋白不易溶于水，且使用的通常为牛或猪来源的胶原，分子量大小不等，性质非常复杂，难于进行进一步的加工，存在动物病毒隐患，限制了其作为生物材料在医疗器械等领域的应用。因此，研究通过基因构建技术，利用生物反应器表达重组胶原蛋白来解决这些问题，且已经取得良好进展。

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是一种外源蛋白表达系统，既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统不具有的对外源蛋白的修饰如糖基化、蛋白磷酸化等特点。在过去的20年中已有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达，其中许多产品已被广泛应用于临床的诊断治疗和科研工作中。在毕赤酵母表达系统中外源基因不是存在于自主复制的表达载体中，而是和表达载体一起通过同源重组整合在酵母染色体上，随染色体一起复制和遗传，不会发生外源基因的丢失现象；毕赤酵母具有强烈的好氧生长偏爱性，可实现细胞高密度培养，利于大规模工业化生产；毕赤酵母可高水平分泌表达外源蛋白，发酵产物的累积不会对其产生毒副作用，并且毕赤酵母自身分泌到培养基中的蛋白很少，便于纯化。

发明内容

本发明的目的在于提供一种亲水性优异的重组人源III型胶原蛋白，以及分泌表达该蛋白的毕赤酵母工程菌及其构建方法，能高效、安全地进行重组人源III型胶原蛋白的胞外分泌表达。

实现本发明目的的技术方案如下：

本发明的重组人源III型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。

本发明的重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。

本发明构建的重组人源III型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa的核苷酸序列如SEQNo.4所示，通过将重组人源III型胶原蛋白的编码基因Ⅲα498aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。

本发明构建的分泌表达重组人源III型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris JY0301，保藏编号为CGMCC No.16462，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0301通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Ⅲα498aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。

本发明从已知序列的人体胶原蛋白基因III型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本发明的重组人源III型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，在生物医用材料、化妆品等领域具有潜在的应用前景。

附图说明

图1为人Ⅲ型α链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。