[发明专利]一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用

说明书

本发明提供了一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用，涉及微生物诱变育种领域。以经过空间诱变筛选的菌株为出发菌，对其进行了常压室温等离子诱变，经多重抗性筛选、高通量筛选以及逐级放大验证筛选，得到了一种高产辅酶Q10类球红细菌，已保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏编号为CGMCC No.16625。本发明获得的类球红细菌突变株，经20m³发酵生产验证，其平均效价可达2694μg/mL，辅酶Q10的产量显著提高，另外，该菌株还具有四重抗性，其应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及微生物诱变育种领域，具体涉及一种高产辅酶Q10类球红细菌及其诱变选育和应用。

背景技术

辅酶Q10(CoenzymeQ10，CoQ10)又称泛醌，化学名称为2，3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊烯苯醌，是一种类维生素物质，以极低的含量存在于动物、植物、微生物等细胞内，并能在所有的有机体组织中合成。辅酶Q10是生成ATP的必需辅酶和天然的抗氧化剂，参与细胞代谢活动，能够激活改善人体细胞，增强人体免疫系统功能，已广泛应用于保健品、食品、化妆品等行业。

生产辅酶Q10原料的方法主要有生物提取法、化学合成法和微生物发酵法，其中微生物发酵法生物活性高、原料成本低并可通过规模放大提高生产能力，被公认为是最具优势和潜力的一种技术工艺。自然界中生产辅酶Q10的菌株主要有红螺菌属(RhodospirillumMolisch)、土壤杆菌属(Agrobacterium Conn)、副球菌属(Paracoccus Davis)、假单胞菌属(Pseudomonasaeruginosa)、假丝酵母属(Candida)等，其中类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)是目前用来大规模发酵生产辅酶Q10的主要生产菌株之一。类球红细菌在通过循环光合磷酸化过程获得生长繁殖能量的同时，需要大量积累的辅酶Q10来消减光合作用产生的自由基。通常野生型微生物辅酶Q10的积累量只有(0.8-3.3)mg/g DCW，发酵水平(30-130)mg/L，无法满足工业大规模发酵生产的要求。目前，一般是通过高产菌种的选育与改造和发酵条件与过程控制的优化两种途径提高辅酶Q10的微生物发酵水平，获得辅酶Q10高产菌株的主要方法还是利用传统的物理或化学方法进行诱变育种，物理诱变具有方法简单、安全性高、成本低以及收获大等优点。

常压室温等离子体(ARTP)被称为除气体、液体、固体以外物质的第四态，通过改变激发方式和发生器结构可以产生不同热力学状态的等离子体。等离子体具有臭氧浓度及紫外辐射强度均极低，安全性高、环境友好、诱变快速等特点，常压室温等离子体诱变操作简单，条件温和，菌株突变率高、突变点位和跨度广泛。ARTP工作气源种类、流量、放电功率、处理时间等条件均可控，通过改变仪器操作条件，可以大大提高菌种突变的强度和突变库容量，结合压力筛选和高通量筛选技术，ARTP已经成为高效进化育种的新方法。ARTP诱变一般以致死率作为筛选诱变条件等的指标，致死率不宜过高或过低，有研究表明，致死率越接近90％，诱变效果越好，此时的诱变条件越佳。目前，中国专利公布CN105505915A公开了一种使用ARTP诱变筛选高活性耐受甲醛降解菌突变株的方法，诱变条件为电源功率115W，工作气流量10L/min，等离子体发射源与菌株之间的距离2mm，操作温度23.0-35.0℃，诱变处理时间0.5-3min。

近些年来空间诱变育种被广泛应用于微生物育种，并取得了一定的成果，党磊等(2010)公开了一种利用空间诱变选育辅酶Q10高产菌的方法，利用空间搭载技术对类球红细菌进行空间诱变选育，最终得到名为Shenzhou6的突变株，产量可达(0.8±0.02)g/L。虽然类红球菌经多次空间搭载，进行空间诱变，菌种性能有了大幅提升。但由于同一诱变方式主要引起菌种某些基因固定位点的变化，经过多次搭载后菌株已经具有一定抗性，选育菌种性能提升不明显，出现了“疲劳现象”，制约了辅酶Q10菌种发酵水平的进一步提高。因此，在空间搭载诱变育种的基础上采用一种新型诱变方式对其进行再次诱变，增加诱变位点，筛选高性能突变株是非常必要的。

发明内容