[发明专利]卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用

说明书

本发明涉及一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)‑环氧氯丙烷中的应用。所述突变的位点为下列之一：(1)第81位；(2)第86位；(3)第94位。本发明通过卤醇脱卤酶进行改造获得多株突变株，针对1,3‑二氯‑2‑丙醇转化制备(S)‑ECH具有极高的立体选择性。在磷酸盐缓冲体系中，能够催化制备光学纯度(e.e.值)大于99％的(S)‑ECH。该技术具有酶立体选择性优异，反应体系简单，操作过程易于控制，生产成本低，产品光学纯度高等突出优势，具有良好的工业应用价值。

(一)技术领域

本发明涉及一种来源于放射农杆菌的卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。

(二)背景技术

手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的三碳合成子，在手性药物的制备中有着重要的应用；其中降血脂类药物阿托伐他汀、芳氧丙胺醇类β-肾上腺阻断剂阿替洛尔、减肥药左旋肉碱、治疗心绞痛药物美托洛尔以及抗生素海藻唑啉等多种药物均需要(S)-环氧氯丙烷作为手性中间体参与来完成手性药物的制备，(S)-ECH有着广泛的市场需求。传统的(S)-ECH化学合成工艺从外消旋环氧氯丙烷出发，通过Salan试剂催化水解外消旋环氧氯丙烷，可以得到e.e.值为99％，但是，(S)-ECH的产率为43％，而且，其催化剂成本极高，环境不友好。Xue等通过对来自Agrobacterium radiobacter AD1的HheC进行改造获得突变株HheCP175S/W249P其催化1,3-DCP生成(S)-ECH时，转化率达93.7％，e.e.值为95.3％，但随着反应的进行，e.e.急速下降至零。Zhang等通过对HheC突变株进行固定化获得固定化酶，其在有机相中催化1,3-DCP生成(S)-ECH时，e.e.值达98％，转化率达52.34％。

随着手性药物行业的发展，使得手性环氧氯丙烷作为一种市场前景广阔的手性药物中间体。卤醇脱卤酶法以其合成的步骤短，收率高，环境污染小，理论收率高，成本低等明显优势被广泛关注。受限于卤醇脱卤酶的立体选择性与反应体系障碍，当前的卤醇脱卤酶法制备的手性ECH产品尚不能达到光学纯，不能满足工业化应用的要求。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体及以该突变体制备高产率和e.e.值的(S)-ECH应用，本发明通过对其卤素结合域处蛋白进行改造，获得了能够催化1,3-DCP获得高光学纯和高产的(S)-ECH的突变体。

本发明采用的技术方案是：

一种来源于放射形土壤杆菌的卤醇脱卤酶突变体，由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸经定点饱和突变而来，所述突变的位点为下列之一：(1)第81位；(2)第86位；(3)第94位。

优选的，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第81位异亮氨酸突变为色氨酸(即突变体I81W)、丝氨酸(即突变体I81S)、天冬酰胺(即突变体I81N)、谷氨酰胺(即突变体I81Q)或组氨酸(即突变体I81H)而得。

或者，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第86位苯丙氨酸突变为天冬酰胺(F86N)或天冬氨酸(F86D)而得。

或者，所述突变体由序列如SEQ ID NO：2所示的氨基酸第94位缬氨酸突变为甘氨酸(即突变体V94G)、色氨酸(即突变体V94W)、甲硫氨酸(即突变体V94M)、精氨酸(即突变体V94R)或天冬酰胺(即突变体V94N)而得。

更为优选的，所述突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4(突变体I81W)、SEQ ID NO.6(突变体F86N)或SEQ ID NO.8(突变体V94R)所示。

本发明还涉及所述的卤醇脱卤酶突变体在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用(涉及反应参见图1)。