[发明专利]一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌实时荧光定量PCR引物

说明书

本发明提供一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的实时荧光定量PCR引物，所述引物：上游引物：5’‑TGGATTCAGCGCAATAGCAAG‑3’，下游引物：5’‑TGAGACCTTTTCAAATCCGAGGC‑3’。本发明根据GenBank登录的CP028833.1的PLO基因序列，设计特异性引物，首次建立山羊化脓隐秘杆菌PLO基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌实时荧光定量PCR引物，属于分子生物学领域。

背景技术

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes, A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌，曾被称为化脓棒状杆菌、化脓放线菌。Ramos等根据16 S rRNA基因进行系统进化分析后将化脓隐秘杆菌分类到隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌可寄生于多种动物的上呼吸道、消化道等黏膜处，且与大肠埃希菌、链球菌等混合存在。化脓隐秘杆菌是山羊呼吸道疾病和体表淋巴结炎的重要病原之一，病羊表现渐进性消瘦、流产等症状，病理组织学变化为化脓性炎症。

目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(pyolysin，PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结合蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim)，其最主要的致病因子是细胞外毒素PLO。1997年，Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBR1中克隆测序了PLO全基因。目前有针对化脓隐秘杆菌PLO基因和化脓隐秘杆菌16S rRNA的普通PCR方法。一方面在菌量稍低时灵敏度和重复性不高；另一方面，采用保守的16S rRNA建立的检测方法分辨力不高。SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR是在普通PCR的基础上，在反应体系中加入荧光染料，利用荧光PCR检测仪来检测靶核苷酸序列的技术，具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点。通过查阅文献发现，当前国内外尚未有针对山羊化脓隐秘杆菌PLO基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。本发明的建立可以填补该领域的空白。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌实时荧光定量PCR引物。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- TGGATTCAGCGCAATAGCAAG -3’，

下游引物：5’- TGAGACCTTTTCAAATCCGAGGC -3’。

利用该引物可用于对山羊化脓隐秘杆菌的PLO基因进行检测，尤其适用于SYBRGreen Ⅰ实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测山羊化脓隐秘杆菌PLO基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法。

具体操作方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的山羊化脓隐秘杆菌CP028833.1基因组序列，利用Beacon Designer 7.9 软件对PLO基因序列进行引物设计，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。

2、反应体系的优化：优化出的25μL最佳反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×12.5μL、上、下游引物（10 μmol/L）各1.0μL、模板2μL、水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，60℃，15s，72℃，20s，共40 个循环。

3、阳性标准品的制备：取1 mL山羊化脓隐秘杆菌培养液加入1.5 mL离心管中，10000r/min离心3min，弃上清收集菌体，使用生工组织DNA提取试剂盒提取DNA，利用蛋白质核酸仪测定其浓度，换算成拷贝数，作为阳性标准品备用。