[发明专利]一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的引物和探针

说明书

本发明提供一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑TCATCAACAATCCCACGAAGAGT‑3’，下游引物：5’‑TAGGAGATCTTTGCAGCATGGTCA‑3’，所述探针序列为：5’‑ATTGCGCTGAATCCAACCGTCGAG‑3’。本发明根据GenBank登录的CP028833.1的PLO基因序列，利用Beacon Designer 7.9设计特异性引物和探针，于国内外首先建立山羊化脓隐秘杆菌PLO基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好。

技术领域

本发明涉及一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的引物和探针，属于分子生物学领域。

背景技术

化脓隐秘杆菌(Arcanobacterium pyogenes, A.pyogenes)是一种多形性、无运动性的革兰氏阳性杆菌，曾被称为化脓棒状杆菌、化脓放线菌。Ramos等根据16 S rRNA基因进行系统进化分析后将化脓隐秘杆菌分类到隐秘杆菌属。化脓隐秘杆菌可寄生于多种动物的上呼吸道、消化道等黏膜处，且与大肠埃希菌、链球菌等混合存在。化脓隐秘杆菌是山羊呼吸道疾病和体表淋巴结炎的重要病原之一，病羊表现渐进性消瘦、流产等症状，病理组织学变化为化脓性炎症。

目前已发现的化脓隐秘杆菌毒力因子主要有溶血素(pyolysin，PLO)、神经氨酸酶(Nan)、胶原结合蛋白(CbpA)及菌毛合成蛋白(Fim)，其最主要的致病因子是细胞外毒素PLO。1997年，Billington等从野生型化脓隐秘杆菌BBR1中克隆测序了PLO全基因。

目前对山羊化脓隐秘杆菌的病原学诊断技术方面，国内外已有细菌分离鉴定法和普通PCR方法的报道，虽有关于化脓隐秘杆菌TaqMan的荧光定量PCR方法，但报道的主要是以16S rRNA为主，未见有关于其它基因荧光定量PCR检测方法的报道。普通PCR存在敏感性和特异性较低等缺点，使其在实际应用中受到一定的限制。TaqMan实时荧光定量PCR具有特异性强、定量准确、灵敏度高等优点，尤其适合临床样品的大量检测。本发明的建立可为该菌的病原学检测和流行病学调查提供一种新的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的引物和探针。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：

上游引物：5’- TCATCAACAATCCCACGAAGAGT -3’，

下游引物：5’- TAGGAGATCTTTGCAGCATGGTCA -3’。

一种用于检测山羊化脓隐秘杆菌的探针，所述探针序列为：5’-ATTGCGCTGAATCCAACCGTCGAG-3’。

所使用的探针两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。

利用本发明的引物和探针可对山羊化脓隐秘杆菌的相应基因进行检测，尤其适用于基于实时荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的各种优化，建立了一套可用于检测山羊化脓隐秘杆菌的实时荧光定量PCR方法。具体方法如下：

1、引物设计：根据GenBank上公布的山羊化脓隐秘杆菌CP028833.1基因序列，利用Beacon Designer 7.9 软件对PLO基因序列进行引物和探针设计，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse，采用BLAST工具进行检索，初步验证其特异性。