[发明专利]一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法

说明书

本发明涉及一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，属于植物病原菌诱导产孢技术领域，首先配制产孢培养基，主要成分为V8蔬菜汁，碳酸钙，琼脂粉，25％乳酸和超纯水，然后将活化好的大豆灰斑病病原菌接种于培养基上，25‑28℃恒温培养箱暗培养8‑14天，再用无菌水洗脱分生孢子，显微镜下计量孢子数；本发明大大提高了大豆灰斑病病原菌产孢效率，具有菌落生长快，产孢量大，致病力持久，操作简单，稳定性好等优点，缩短了大豆灰斑病抗性品种鉴定周期，节约了人力物力，具有较高的应用价值，并为大豆灰斑病病害发生规律和防控手段的深入研究提供科学、有效的技术支撑。

技术领域

本发明涉及一种大豆灰斑病病原菌产孢的方法，属于植物病原菌诱导产孢技术领域。

背景技术

大豆灰斑病(Cercospora sojina Hara)是一种多循环性的世界性病害，以发病早、传播速度快、危害重为特点，特别是在大豆成株期流行性暴发，在阴冷潮湿的地区可造成感病品种减产5％-60％，严重影响大豆的产量和品质。

大豆灰斑病属于真菌病害，由大豆尾孢菌(Cercospora)侵染引起，孢子萌发和菌丝生长对温度都有一定的范围要求，空气湿度大的环境也利于该病的发生。大豆灰斑病病菌在现有的马铃薯琼脂培养基培养技术条件下，存在病菌生长速度缓慢，产孢时间长，易杂菌污染，不产孢或产孢数量少，孢子致病力下降等问题，不但阻碍了大豆灰斑病病原菌生活史和病害发生规律的研究，而且不利于开展对抗病品种进行鉴定筛选等相关工作。

因此，如何获得足量的、致病力稳定的分生孢子成为了当前大豆灰斑病理论研究和实践工作中首要解决的问题及技术难点。改进和提高现有大豆灰斑病病原菌产孢技术体系，可加快培育优良抗病品种，促进大豆产业的健康发展，同时也为灰斑病科学有效的防治方法提供了更有力的技术支撑。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明提出了一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，不但可以有效解决传统方法不能很好的满足病原菌生长发育产生分生孢子的技术难题，而且具有菌落生长快、产孢量大、致病力持久等优点，可显著缩短抗性大豆品种的鉴定周期，加快培育优良大豆新品种，为进一步相关科研工作奠定了良好的基础。

为了实现上述的目的，本发明采用以下的技术方案：

一种大豆灰斑病病原菌快速大量产孢的培养方法，包括以下操作步骤：

1)病原菌菌种的活化：采用常规的组织分离法将大豆灰斑病病原菌进行单孢分离，取分离得到的大豆灰斑病病原菌保存于4℃冰箱备用，待使用时，取出置于32-35℃酒精浴槽中轻微晃动60s，然后将菌丝块与适量的无菌水研磨制成菌丝悬浮液，再在菌种活化培养基上加入0.2-0.25mL菌丝悬浮液，用曲玻棒涂抹均匀，活化培养，得病原菌备用；

2)产孢培养基的制备：取V8蔬菜汁(采用美国进口V8蔬菜汁，市售采购即可)，向其中加入适量碳酸钙混合溶解，将得到的V8蔬菜汁碳酸钙溶液以4000r/min离心10min，取上清液，然后加入超纯水定容至1000mL，再向其中加入琼脂粉，将其在高压灭菌锅内灭菌20min，取出冷却后在超净台内将其分装在培养皿中，同时每个培养皿加入25wt％乳酸，即得产孢培养基；

3)病原菌接种：取已经活化好的病原菌接种于产孢培养基上，然后放入25-28℃恒温培养箱中，黑暗条件下培养8-14天；

4)洗孢计数：在产孢培养皿中倒入适量无菌水，轻磨菌落，洗下分生孢子，用无菌纱布过滤后在显微镜下计量孢子数。

优选的，步骤1)中菌丝悬浮液中菌丝块与无菌水的质量体积比为1:2-4。

优选的，步骤1)菌种活化培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基。

优选的，步骤1)中活化培养时间为6-8天，温度为24-26℃。