[发明专利]一种无标记阿片受体NOP的细胞筛选模型

说明书

本发明提供了一种无标记阿片受体NOP的细胞筛选模型。本发明基于无标记细胞整合药理学技术，利用NOP稳定表达的细胞系，建立了筛选NOP受体的激动剂和拮抗剂的方法。此方法还可以用于研究影响NOP受体下游通路的调节剂。本发明构建的NOP细胞筛选模型不需要荧光标记且检测过程无需额外添加指示剂，具有靶点‑通路整合响应、对细胞无损伤、检测结果可靠、灵敏度高、筛选通量高及操作简便等特点。其用于从天然产物库、代谢产物库及组合化学库中寻找NOP受体的激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及NOP受体参与的伤害感受、药物滥用副作用及心血管疾病的药物筛选。

技术领域

本发明涉及细胞筛选领域，具体涉及一种无标记阿片受体NOP的细胞筛选模型。

背景技术

G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)是细胞信号传导中最重要的一类膜受体，也是小分子药物开发中最受关注的药物靶点之一，约34％的现代药物直接靶向该受体家族。NOP(孤啡肽Receptor)受体，于1994年在利用低严格性的寡核甘酸探针筛选cDNA库的方法时被克隆，与阿片受体结构相似，但是和阿片受体的很多配体的亲和力均很低，被命名为孤儿阿片受体；NOP受体的配体痛敏肽(孤啡肽)和孤啡肽FQ(Orphanin FQ)于1995年被发现并命名。作为阿片受体家族，NOP和N/OFQ已被广泛评估其在伤害感受途径和抗伤害感受作用中的作用，但是目前为止不论是NOP激动剂还是拮抗剂，在疼痛治疗中的作用还尚未十分明确。研究表明，NOP受体在调节与药物滥用相关的奖励和激励途径中起作用；N/OFQ(孤啡肽/Orphanin FQ)的应用已被证明可降低中脑边缘通路中药物刺激的多巴胺水平；此外，阿片类丁丙诺啡(μ受体的不完全激动剂)运用可减少人类酒精成瘾者和酒精偏好动物模型中的酒精消耗，这归因于对NOP受体的不完全激动活性；这些研究表明，NOP受体激动剂具有作为治疗药物滥用的潜力，因此，建立NOP受体细胞模型，对发现NOP受体激动剂和拮抗剂，进一步发现NOP受体生理学功能和药理学特征具有重要的意义。

目前受体的高通量筛选方法主要有传统的放射性配体受体结合实验法、GTPγS结合实验法、环磷酸腺苷(cAMP)分析法、钙流检测法、报告基因检测法、受体的内吞检测法及β-arrestin的招募检测法等。这些方法都有一定的局限性，如传统的放射性配体受体结合实验法需要洗涤和过滤，实验周期长及通量低等不足，此技术还不能区分受体的激动剂和拮抗剂；其余的GPCR检测方法主要针对某条信号通路的激活，往往不考虑多条通路的激活，常常需要荧光蛋白标记或者额外加入指示剂，使操作变得繁琐，而且这些指示剂的加入对细胞也会产生一定的损伤，影响筛选结果的可靠性。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的问题，借助于新型无标记细胞整合药理学技术，提供一种无标记阿片受体NOP的细胞筛选模型，以高通量筛选NOP受体激动剂、拮抗剂和通路调节剂，及NOP受体参与的伤害感受、药物滥用副作用及心血管疾病的药物筛选应用。

本发明的技术方案为：

基于无标记细胞整合药理学技术，利用稳定表达NOP的细胞系HEK-293-NOP，借助于已知的激动剂和拮抗剂，建立NOP受体的细胞筛选模型。根据待测样品的DMR信号谱与已知激动剂和拮抗剂的DMR特征信号谱的相似性，判断待测样品的激动活性、拮抗活性或者下游通路的调节影响。

所述的无标记细胞整合药理学技术为利用共振波导光栅(RWG)生物传感器将药物导致的细胞内成分的动态再分布现象转化为整体的、动态的波长位移响应信号，此信号为波长变化的响应值(pm)，通过Epic光学生物传感器384微孔板实现。

一种无标记阿片受体NOP的细胞筛选模型的建立过程为：

1)在细胞兼容的具有光学生物传感功能的384微孔板中接种HEK-293-NOP细胞，接种的细胞密度为1.0～4.5×10⁴个/孔，细胞培养液体积为40μL/孔，接种后细胞培养时间为18～24h；