[发明专利]一种内肽酶活力测定的新方法

权利要求书

1.一种内肽酶活力测定的方法，其特征在于，步骤如下：

1)标准曲线的绘制

以缩二脲浓度为横坐标x，吸光度OD值为纵坐标y，绘制标准曲线方程：y=ax+b，变形得方程-1：x=（y-b）/a；方程中a，b为常数，分别代表曲线与x轴和y轴的交点，r²≥0.99；所述缩二脲浓度单位：mg/mL；

2)粗酶液提取

对于固体样品，先粉碎过80目筛；参照食品安全国家标准GB5009.3-2016食品中水分的测定，计算固体样品粉末的水分含量，记为w；取粉碎后的待测固体样品适量，记为m，加入样品质量4倍的pH5.2、浓度为0.1mol/L的柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液，4℃条件下磁力搅拌30min，用pH5.2，浓度为0.1mol/L柠檬酸－磷酸氢二钠缓冲液定容至V；4℃条件下过滤收集上清液作为待测粗酶液；

对于液体样品直接取样，记为V₀ ，置于冰浴中，缓慢加入95%乙醇溶液，使体系中乙醇的终浓度为60% v/v，静置沉淀后，抽滤，得湿酶粉；于4℃冰箱保存；测定酶活时，用浓度为0.05mol/L、pH6.0的柠檬酸―磷酸氢二钠缓冲液复溶并定容至V，即得到待测粗酶液；

3)实验组的测定

实验组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液，记为v，用浓度为0.2 mol/L，pH4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL进行反应，加入牛血清白蛋白溶液后在50℃水浴中的反应时间记为h；加入0.8mL浓度为15%三氯乙酸溶液终止反应；4℃静置30min，5000r/min离心10min收集全部上清液；向上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值；三个平行吸光度值分别记为y1，y2，y3；y1，y2，y3分别代入方程-1计算实验组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x1，x2，x3；计算平均值`x1（mg/mL）=（x1+x2+x3）/3；

4)对照组的测定

对照组设3个平行处理；每个平行处理分别取待测粗酶液v，用浓度为0.2 mol/L，pH4.5醋酸-醋酸钠缓冲溶液补足待测粗酶液体积至2mL；50℃水浴预热10min后加入牛血清白蛋白溶液1mL后立即加入0.8 mL浓度为15%三氯乙酸溶液，漩涡混合器充分混匀，使蛋白质沉淀，在50℃水浴中的反应时间记为h；5000r/min离心10min收集全部上清液，上清液中添加4mL碱性硫酸铜溶液，用漩涡混合器充分摇匀，在室温下放置30min，于540nm波长下测定吸光值，三个平行吸光度值分别记为y₀₁，y₀₂，y₀₃；将对照组的三个吸光度值分别代入方程-1计算对照组反应体系中与每个平行吸光度值对应的缩二脲的浓度x₀₁，x₀₂，x₀₃，计算平均值`x₀（mg/mL）=（x₀₁+x₀₂+x₀₃）/3；

5)酶活力计算

固体样品内肽酶活力按照如下公式3计算；

液体样品内肽酶活力按照如下公式4计算；

公式3）、4）中：

U：内肽酶活力单位，单位：u

实验组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

对照组缩二脲浓度平均值，单位：mg/mL

7：单位：mL

h：酶与底物反应时间，单位：min

m：固体待测样品的取样量，单位：g

V：粗酶液提取中定容的体积，单位：mL

v：反应组和对照组试管中加入粗酶液体积，单位：mL

w：样品水分含量，单位：%

V₀：液体样品取样的毫升数，单位：mL。

2.如权利要求1所述一种内肽酶活力测定的方法，其特征在于，所述步骤2）中，根据原料酶活力大小调整定容体积V，酶活力大适当增大定容体积，使实验组与对照组540nm下的吸光度差值至少为0.1。