[发明专利]一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置及其使用方法

说明书

本发明提供了一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置及使用方法。装置包括上层的密封盖、中层的微孔阵列、和下层的生化传感器芯片。使用时，注入微孔中的待测液体接触孔内下方的传感器，且不同微孔中的液体被密封盖密封而相互隔离。本发明可以将PCR反应分隔在上万个微小单元，微孔内进行单分子样本的PCR扩展反应，通过检测PCR过程中释放出的氢离子、磷酸根离子或焦磷酸根离子的浓度变化来检测阳性反应单元的数量，进而准确对DNA样品进行定量。本发明采用高度集成的半导体芯片来完成数字PCR的检测，不仅将反应体系大幅缩小，仪器小型化，并克服了对荧光激发和检测装置的依赖，且避免了荧光染料或荧光探针的使用，大幅降低了数字PCR的仪器及试剂成本。

技术领域

本发明属于核酸检测领域，尤其涉及一种基于微孔阵列芯片的数字PCR检测方法。

背景技术

现代生物学研究，特别是医学研究时常涉及对核酸定量分析的需求。比如检测血液中某些游离DNA及其含量，可以指导某些癌症的临床诊断，以及监控癌症的治疗效果。以往的定量主要采取荧光定量PCR进行相对定量，即选取一个表达稳定的基因的转录物作为参照，来评判目的核酸的量的高低。但这种方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干扰，只适用于定性或者低精度检测，无法满足某些含量特别稀少的目标核酸分子的检测。

数字PCR(dPCR)则能通过大规模的平行PCR扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中提炼出来，以“终点信号的有或无”来统计被扩增的分子的个数。到目前为止，已经发展出了各式各样的dPCR装置，主要有孔板式和液滴式。

孔板式dPCR就是在足够数量的同尺寸微孔阵列排布的平板上离散化核酸分子，实现数字化扩增。例如：ThermoFisher公司推出的QuantStudioTM 3D dPCR系统就是采用这种方式。它在一块10mm边长正方形平板上蚀刻出高达20000个六角形微孔，每个微孔容积0.8nL，实现微孔间隔离，通过简单涂刷上样，每个微孔有1个左右的目标核酸分子；PCR后就可检测孔中荧光信号，通过泊松分布计算目标分子的个数。

液滴式dPCR则是通过数以万计的单分散性小液滴来分割样本，液滴借助疏水的管道和油相液体，把DNA分散与各个油包水小液滴，一个液滴理论上只含有一个左右的DNA分子；DNA扩增后可以转移到荧光检测装置进行最终检测。该方法的缺点是液滴容易在PCR过程或者转移过程中出现液滴相互汇合的情况，导致结果不准确。

以上各种dPCR的技术都采用荧光信号来读取结果，这就要求配套装置中含有昂贵的荧光激发装置和耗材、荧光高分辨率检测装置。另外，光信号的相互污染也会增加判断结果难度。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增方法。

为解决上述技术问题，本发明提供一种基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置，包括微孔阵列芯片本体，所述微孔阵列芯片本体包括密封盖、微孔阵列以及生化传感器，所述密封盖置于所述微孔阵列上方，用于密封微孔阵列的微孔并使各个微孔之间相互隔离，所述生化传感器置于微孔底部，所述密封盖或生化传感器上设有用于向微孔内溶液提供电压的电极。

进一步，所述微孔阵列中含有0.1万～1000万个微孔，每个微孔的容积为1fL～10pL。

进一步，所述生化传感器的表面涂有氢离子敏感材料、磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料。

进一步，所述氢离子敏感材料为SiO₂、Al₂O₃、HfO₂、TiO₂、Ta₂O₅、(3-氨丙基)三乙氧基硅烷、三乙氧基硅基十一醛中的一种或多种叠层。

进一步，所述磷酸根离子或焦磷酸根离子敏感材料为磷酸离子有机膜ISM或分子探针。