[发明专利]靶向/免疫调节性融合蛋白及其制造方法

权利要求书

1.一种制备治疗活性抗体-肽融合蛋白的方法，所述方法包括：

制备所述抗体-肽融合蛋白的密码子优化的核苷酸序列，其中所述密码子优化的核苷酸序列包含CG序列的增加，其中所述抗体-肽融合蛋白包含靶向组成部分和免疫调节组成部分，其中所述靶向组成部分和所述免疫调节组成部分通过选自SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：11的氨基酸间隔物相连，其中所述免疫调节组成部分是包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的TGF-βRII；其中所述靶向组成部分选自：由重链SEQ ID NO：5和轻链SEQ ID NO：6构成的抗EGFR1抗体、由重链SEQ ID NO：1和轻链SEQ ID NO：2构成的抗HER2/Neu抗体、以及由重链SEQ ID NO：7和轻链SEQ ID NO：8构成的抗CTLA4抗体，其中SEQ ID NO：4通过氨基酸间隔物连接至抗HER2/Neu抗体的SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的C-端、抗EGFR1抗体的SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的C-端、抗CTLA-4抗体的SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8的C-端；

将所述抗体-肽融合蛋白的优化的序列克隆到能够瞬时或持续表达的中华仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞中；

在发酵培养基中在适合生长的条件下生长CHO宿主细胞并允许所述CHO宿主细胞表达克隆的蛋白，其中所述发酵培养基包含二价过渡金属盐；以及

对表达的抗体-肽融合蛋白进行纯化，并任选地检查所述抗体-肽融合蛋白对其靶的双特异性结合能力。

2.权利要求1的方法，其中在一开始或以补料分批方式向细胞培养物引入所述二价过渡金属盐。

3.权利要求1的方法，其中所述二价过渡金属盐包括锌离子。

4.权利要求3的方法，其中所述二价过渡金属盐是七水硫酸锌。

5.权利要求1的方法，其中所述二价过渡金属盐的量足以减少培养期间乳酸的积累。

6.权利要求5的方法，其中在整个运行中，乳酸减少差不多10～40％。

7.权利要求1的方法，其中以约0.3mM至约0.4mM的浓度将所述二价过渡金属盐添加至培养基中。

8.权利要求1的方法，其中在前3～4天将所述发酵培养基维持在37±1℃的温度下，然后降至31±1℃直至第7天。

9.权利要求1的方法，其中所述发酵培养基包含约0.3～0.45x10⁶的初始细胞计数。

10.权利要求1的方法，其中使用具有特定pH的Mab Select Xtra蛋白A柱对所表达的抗体-肽融合蛋白进行亲和层析。

11.权利要求1的方法，其中将结合并通过所述Mab Select Xtra蛋白A柱的上清液的pH调整到所述蛋白A柱的特定pH。

12.权利要求1的方法，其中所述抗体-肽融合蛋白通过所述抗体的Fc区域结合至柱子，而杂质作为通流物被消除。

13.权利要求1的方法，其中使用pH 3.0的甘氨酸洗脱结合至柱子的抗体-肽融合蛋白，然后调整至中性pH用于储存。

14.权利要求1的方法，其中将纯化的蛋白储存在-20℃或2-8℃。