[发明专利]油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用

说明书

本发明属于植物保护技术领域，公开了油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，本发明提供了L.biglobosa ‘brassicae’（Lbb）特异性检测靶标，该靶标具备特异好、稳定性强和灵敏度高的特点，对于有着较高的同源性油菜黑胫病菌近缘种和亚种都能很好的区分，避免了假阳性的产生。针对该靶标设计的LAMP引物，可以检测到132fg/μL的L.biglobosa ‘brassicae’基因组DNA，为油菜黑胫病菌亚种Lbb快速检测和鉴定提供了一种灵敏快速的工具。

技术领域

本发明属于植物保护技术领域，具体涉及油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用。

背景技术

油菜黑胫病(Blackleg)是一种世界性的油菜病害。据报道，在每个油菜生产季，造成的全世界经济损失高达9亿美元以上(Fernando et al.,2016)，其病原菌是小球腔菌属真菌，可严重危害油菜等十字花科植物。小球腔菌属(Leptosphaeria)真菌包括两个近缘种：L.ma culans和L.biglobosa(Shoemaker and Brun.,2001)(Kaczmarek.,2009)。这两种病原菌在加拿大、澳大利亚、欧洲均有分布(West et al.,2001)，而我国目前仅报道了L.bigl obosa，尚没有发现L.maculans。因此，我国于2007年5月28日将L.maculans列为我国禁止进境的植物检疫性病原菌(周国梁，2010；周圆等，2016)。

油菜黑胫病菌包括了六个亚种或亚类，即L.biglobosa‘brassicae’(在本发明中简写为Lbb)、L.biglobosa‘canadiensis、’L.biglobosa‘australensis、’L.biglobosa‘occiaustralensis、’L.biglobosa‘thlaspii’和L.biglobosa‘erysimii’，其中，L.biglobosa‘canadiensis’是加拿大的优势种群，L.biglobosa‘brassicae’是东欧和亚洲的优势种群(Mendes-Pereira et al 2003；Vincenot et al 2008)。造成我国油菜黑胫病的主要是L.biglobosa‘brassicae’(Liu et al.,2014)。油菜黑胫病菌主要侵染油菜茎部，在侵染部位形成黄褐色的裂口病斑，严重时造成茎秆倒伏，严重威胁着油菜的生产安全。目前，对于油菜黑胫病的防治，主要还是依靠对油菜产区进行重点监测，及时掌握病害危害和病原菌小种变化趋势，据此建立统防统治的防控体系(荣松柏等，2018)。现在已经有AFLP及ISSR等方法应用到油菜黑胫病菌亚种的检测鉴定工作中(Liu et al.,2014；郝丽芬等，2014)。但是，现存的检测方法周期长、对仪器设备以及工作人员要求高、检测步骤繁杂等劣势，难以满足田间的实时快速检测的要求。因此，一种快速、准确、灵敏简便的检测技术对于口岸检测油菜黑胫病菌显得尤为重要。

针对上述问题，本发明提供了油菜黑胫病菌Lbb特异性序列，该序列在油菜黑胫病菌中特异性存在，能对近缘种及亚种进行很好的区分；同时针对该序列，设计了油菜黑胫病菌Lbb的特异性LAMP检测引物，建立一种适用于田间的LAMP快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供了油菜黑胫病菌亚种的特异性序列在油菜黑胫病菌检测中的应用，所述的油菜黑胫病菌亚种的特异性序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的在于提供了检测SEQ ID NO.1所示序列的试剂在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。

本发明的还有一个目的在于提供了针对SEQ ID NO.1所示序列设计的引物在制备油菜黑胫病菌检测试剂中的应用。