[发明专利]苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用

说明书

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及苹果蠹蛾特异性SS‑COII引物及其应用。本发明的特异性引物只对苹果蠹蛾具有扩增能力，扩增产物大小为262bp，对单粒卵及成虫残体亦有良好的检测效果，本发明提高了苹果蠹蛾检测的准确性，节约了检测时间，适宜以试剂盒的形式在进境植物检疫、国内植物检疫和田间防治中推广。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及苹果蠹蛾特异性SS-COII引物及其应用。

背景技术

苹果蠹蛾Cydia pomonella L.，别称苹果小卷蛾、苹果食心虫，属鱗翅目Lepidoptera、卷蛾科Tortricidae、小卷蛾亚科Olethreutinae、小卷蛾属Cydia，是一种世界性检疫害虫，被列为世界仁果类水果最严重的蛀果害虫之一，是我国重要的对外和对内检疫对象。苹果蠹蛾的寄主范围广泛，因此，加强对苹果蠹蛾的监测检测，是保障水果产业以及干果/坚果产业健康发展的必要前提。

苹果蠹蛾幼虫为钻蛀型昆虫，常隐蔽发生，尤其在发生初期很难及早发现，传统形态学鉴定方法的难度大，准确性低，加强检疫和监测必需建立一套快速准确的分子检测方法。目前国际上用于苹果蠹蛾鉴定的方法主要有：1)形态特征鉴定；2)PCR技术等。但目前国内针对苹果蠹蛾尚没有标准的检测方法。

COI和COII技术曾用于鉴别苹果蠹蛾及其近缘种。mtDNA COI和mtDNA COII技术检测是利用通用型的引物，在DNA聚合酶的催化下，对目标DNA进行体外扩增，然后将PCR产物回收、纯化、测序，根据序列比对和系统发育树构建来判断检测结果。而靶标种特异性SS-COII PCR检测技术是在mtDNA COII技术的基础上发展起来的特异序列扩增区域标记，是利用特异性的引物，根据预期DNA条带的有无及大小来判断检测结果，无需测序和序列比对，具有灵敏度高、特异性强、快速、简便且重现性好和稳定性强等优点。

特异性引物的设计依赖于数据库中已有的序列信息。目前，数据库中蛀果类害虫的已知COII序列较少，其中相关的物种数量仅为11种，加上香梨优斑螟Euzopherapyriella Yang、枇杷暗斑螟Euzophera bigella(Zeller)和3种未知的物种，现有所掌握的序列信息共16种。同时，分析显示，上述不同物种间的碱基序列的同源性比较高，难以找到靶向苹果蠹蛾的特异性区段。

发明内容

本发明的目的在于提供一对苹果蠹蛾特异性SS-COII引物。

本发明的再一目的在于提供苹果蠹蛾特异性检测方法。

本发明的再一目的在于提供苹果蠹蛾检测试剂盒。

根据本发明的具体实施方式的苹果蠹蛾特异性SS-COII引物，引物序列为：

CPZWF1：5′-ACCATCATTACGTTTATTATAC-3′；

CPZWR1：5′-AATTGTTCAGGAATGGATG-3′。

使用上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物扩增获得苹果蠹蛾特异性基因片段，其核苷酸序列为：

根据本发明具体实施方式的苹果蠹蛾特异性检测方法，所述方法包括使用上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物进行PCR扩增的步骤。

根据本发明具体实施方式的苹果蠹蛾特异性检测试剂盒，所述试剂盒包括上述苹果蠹蛾特异性SS-COII引物。

本发明的有益效果：

(1)检测准确性高，本发明的根据苹果蠹蛾种特异性SS-COII标记设计的引物CPZWF1和CPZWR1，在PCR快速检测苹果蠹蛾时，可扩增出262bp的片段，不仅对苹果蠹蛾的单头成虫、2-5龄幼虫可以进行检测，对于单粒卵和单头初孵幼虫也能准确检测；