[发明专利]一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用

说明书

本发明公开了一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用，该试剂包括Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、指示剂、保护剂和气溶胶污染预防剂；将上述组分混合，在‑70～‑80℃下冷冻干燥8～16h，即可得环介导等温扩增试剂。本发明制备了一种用于核酸检测的环介导等温扩增试剂，能够常温运输保存，运输方便，稳定性好；同时解决了气溶胶污染限制了LAMP技术推广的问题，大大降低了LAMP技术的应用和推广难度。试剂中Bst DNA Polymerase活性为150％，可常温保存一年以上，使用时仅需加入缓冲液即可，操作简单，DNA聚合酶活性高，检测灵敏度无损失，保护剂干扰小，成本低廉。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用。

背景技术

环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是日本荣研株式会发明的一种核酸体外扩增技术，根据靶标基因的6个区域，设计4条特异性引物，利用Bst DNA Polymerase的链置换作用可以在60～65℃条件下，1小时内完成10⁹～10¹⁰倍的扩增。由于LAMP扩增过程依赖识别靶序列6个独立区域，所以反应特异性很强，并且核酸扩增过程是在恒温条件下进行，普通水浴锅或者有稳定热源的设备就能满足反应要求。相对于普通PCR技术，LAMP技术具有操作简单、检测快速、特异性高、成本低等优点。

目前，LAMP已成功应用于结核分枝杆菌的检测，并得到WHO的认可及大力推广。但是，由于LAMP反应所需要的Bst DNA Polymerase、dNTP和引物等成分需要在低温条件下运输保存，且该类产品需要专业技术人员按照说明书进行操作。同时，LAMP技术的气溶胶污染容易造成假阳性结果也进一步增加了该技术的应用及推广难度。

冷冻干燥技术又称升华干燥，是一种将含水物料在冰点以下和较高真空条件下直接去除水分的干燥方法。可以避免热敏性物质发生生物、化学或物理变化，并最大限度保持原料的活性和物理、化学性质。然后对物质进行检测。目前针对生物活性原料冷冻干燥后的检测试剂多使用海藻糖、蔗糖、乳糖等二糖与生物大分子组合。但这类产品用于LAMP技术时使用浓度较高，非还原性二糖需要在200mM以上浓度才能有效发挥作用，而且会抑制后续反应，对其下游检测往往造成一定影响；并且会造成气溶胶污染，影响检测结果。

发明内容

针对现有技术存在的局限性，本发明的目的是提供一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及其应用，解决现有的试剂使用浓度高、易造成气凝胶污染且对下游检测产生影响的问题。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案予以实现：

一种可常温运输的环介导等温扩增试剂，包括Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、指示剂、保护剂和气溶胶污染预防剂；

所述的引物混合物中包含引物FIP、BIP、LF、LB、F3和B3；

所述的指示剂中包含HNB溶液和Gelgreen溶液；

所述的保护剂中包含牛血清白蛋白、大豆卵磷脂、甘露醇和羟乙基淀粉；

所述的气溶胶污染预防剂中包含甘草甜素、海藻酸钠和叔丁醇。

具体的，Bst DNA Polymerase、dNTP、引物混合物、指示剂、保护剂和气溶胶污染预防剂按照体积比例为1～2:3～7:1～2:1～2:5～8:3～7的比例混合。

具体的，所述的引物FIP、LF和F3按照物质的量浓度比例为4～8:2～4:1～2混合，引物BIP的浓度与FIP相同，引物LB的浓度与LF相同，引物F3的浓度与B3相同。