[发明专利]一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法

说明书

本发明涉及一种肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸的制备方法。该试纸由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、PVC板组成。结合垫上喷涂有彩色乳胶微球偶联的鼠抗人IgG单克隆抗体，硝酸纤维素膜上包被有肺炎克雷伯菌融合抗原的检测线和羊抗鼠IgG多克隆抗体的质控线。当加入的样品中含有肺炎克雷伯菌抗体时，肺炎克雷伯菌抗体首先与乳胶‑鼠抗人IgG单克隆抗体形成复合物，在毛细作用下迁移至包被有肺炎克雷伯菌融合抗原的检测线时被捕捉，检测线呈相应的彩色，因而可检测样品中是否含有肺炎克雷伯菌抗体。该试纸条具有快速、简捷、灵敏度高，特异性好，假阳性低的优点，能在十分钟之内得到明确的结果，有效用于肺炎克雷伯菌感染的辅助诊断。

技术领域

本发明属于生物工程和免疫学领域，具体涉及一种基于肺炎克雷伯菌融合抗原的肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条及其制备方法。

背景技术

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)，又称肺炎杆菌或Friedlander杆菌，是最早被认识可引起肺炎的革兰阴性杆菌。半个世纪以前，革兰阴性杆菌肺炎(gram-negative bacillary pneumonia，GNBP)曾被认为是一种非常少见的疾病，很少受到临床关注。除克雷白杆菌外，几乎没有关于革兰阴性杆菌(gram-negative bacterium，GNB)引起肺炎的报道。近二、三十年来，随着易感人群的改变、抗菌药物广泛应用与耐药菌的变迁以及各种微生物检测技术的提高与普及，GNBP已成为进入抗生素时代的现代医学的一种重要疾病。肺炎克雷伯菌常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。据北京协和医院的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎的发病率为40.9％。世界范围的统计，肺炎克雷伯杆菌肺炎占全部肺炎1％～8％，仅次于铜绿假单胞菌及金黄色葡萄球菌肺炎。社会获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的实际调查受到诸多因素的限制，缺乏统一的报告。肺炎克雷伯杆菌肺炎占CAP中革兰阴性杆菌肺炎发病率的16％～64％，现认为肺炎克雷白杆菌是CAP常见的病原菌之一。

鉴于近年肺炎克雷伯菌的耐药率有进一步上升的趋势，这应当引起临床医师及微生物界的高度重视。临床医师应重视获得性肺炎克雷伯菌感染，与临床微生物实验室密切协作，加强感染的监测，有效预防和控制感染。

目前检测呼吸道中该病原体的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定法，该方法所需时间长，一般要2-3天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技术，是一种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，而增菌液中往往还有PCR抑制剂，从而影响扩增的效果，假阳性也是该法的一个突出缺点。同时，该技术还需要专业的检测设备，不适合进行床旁检测。以抗体为诊断标的的免疫学检测已成为人体病原微生物感染检测不可或缺的重要技术手段。目前已发展了多种特异性免疫检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、化学发光免疫分析(CIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中免疫乳胶试纸条等多种以抗原抗体为基础的免疫学检测技术，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点已成为病原微生物检测不可或缺的重要手段。因而，研究开发具有自主知识产权的病原微生物的标志性抗原，是开发拥有自主知识产权的ELISA、乳胶微球免疫层析等进行病原体抗体检测的方法的基础。

抗原的制备是抗体检测特异性的关键。肺炎克雷伯菌fepA、GlpQ、及mltD蛋白均是位于细胞表面的重要结构蛋白，其保守性高，特异性强，免疫原性强，表面暴露性高，是较为理想的抗原标志物。本研究选用具有种间特异性的表面蛋白fepA、GlpQ及mltD等作为抗原标的，制备特异性良好的融合抗原，并将其应用于制备肺炎克雷伯菌抗体乳胶微球免疫层析检测试纸条。

发明内容

本发明的目的是以融合抗原为基础，通过免疫乳胶标记技术研制一种操作简单、成本低廉、快捷迅速的检测人血清中肺炎克雷伯菌抗体的乳胶微球免疫层析检测试纸条。