[发明专利]一种高效制备甘草次酸的重组酶及方法

说明书

本发明“一种高效制备甘草次酸的重组酶及方法”，属于酶工程领域。所述重组酶包括来源于土曲霉的β‑葡萄糖醛酸苷酶AtGUS的TIM桶结构域、及来源于米曲霉的β‑葡萄糖醛酸苷酶PGUS的糖基结构域SBD和免疫球蛋白状β‑三明治结构域IMD。该重组酶AtGUS‑mix性状优良，60℃下的热稳定性比野生酶AtGUS高550％，且比酶活比野生酶AtGUS和PGUS分别高2和6.9倍。重组酶AtGUS‑mix的底物转化率达到95.06％，GA的收率达到98.82％。产物GA终浓度为19.22mM，是野生酶PGUS的5.7倍、AtGUS的2.6倍。

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种高效制备甘草次酸的重组酶及方法。

背景技术

甘草是我国最常用的中药材之一，具有补脾益气，清热解毒，祛痰止咳等功效。其天然提取物甘草次酸(Glycyrrhetinic acid，GA)均具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理作用，广泛用于保肝护肝、抗癌等领域，同时也被广泛的应用于食品、药品和化妆品等领域。

甘草次酸是由甘草酸(Glycyrrhizin,GL)水解两个葡萄糖醛酸基得到的产物，属于五环三萜类化合物。甘草次酸作为一种重要的天然产物，目前合成的主要手段为化学合成法和酶催化法。针对化学合成法存在的环境污染、反应工艺复杂等问题，酶催化具有专一性强、副反应小、反应条件温和等优点，因此已被广泛应用于前体药物的结构修饰等方面。

目前常用于催化甘草酸得到甘草次酸的酶为：β-葡萄糖醛酸苷酶。然而经研究发现，自然界现有β-葡萄糖醛酸苷酶普遍存在含量少、稳定性差、底物特异性不高、催化能力低等问题，远不能满足生产需求。

自上世纪50年代起，国外就有学者对来源于动物体和大肠杆菌的β-葡萄糖醛酸苷酶做了研究，之后各国学者在葡萄球菌、乳酸菌、瘤胃球菌等细菌，青霉菌、曲霉菌、酵母菌等真菌，黄芪、拟南芥、烟草、水稻、玉米等高等植物中检测出该酶的活性。国内外学者有关β-葡萄糖醛酸苷酶的研究主要集中在肠杆菌科和哺乳动物中。可见，野生的β-葡萄糖醛酸苷酶广泛存在于动植物及微生物中，可通过常规技术手段获得各类生物体中的野生β-葡萄糖醛酸苷酶，并且不同类型的生物体中分离得到的野生β-葡萄糖醛酸苷酶的表达量、底物识别能力、催化活性、稳定性、产物得率都各自存在优势和缺陷。

例如，来源于米曲霉的β-葡萄糖醛酸苷酶PGUS在底物识别方面不专一且底物浓度对酶活性影响较大，比酶活不高。而来源于土曲霉的β-葡萄糖醛酸苷酶AtGUS的热稳定性非常差，很难用于大规模发酵生产，同时其表达情况不好。来源于焦曲霉的两种β-葡萄糖醛酸苷酶：AuGUSⅠ和AuGUSⅡ虽然均可水解GL生成GA，但是其活性较差且难于异源表达。除此之外，还有来源嗜松蓝状菌的TpGUS，还有来源于大肠杆菌的EGUS，和人的HGUS等很多种酶。

本领域公知：选取任意两种各自优缺点互补的酶进行重组来获得兼顾二者优点的重组酶，概率是很低的，本领域已报道的成功的重组酶并不多，而通过重组获得比原始野生酶具有显著优势的重组酶的例子几乎没有。

尽管本领域人工制备重组酶的技术手段已非常成熟，但要从几乎无数种不同来源的β-葡萄糖醛酸苷酶中选择野生酶做为改造对象并成功获得可高效制备甘草次酸且适用于甘草次酸大规模工业生产的重组酶并非易事。

因此，本领域亟需开发一种底物识别能力强、催化活性好、稳定性好、产物得率高的新型重组酶，用于高效制备甘草次酸及甘草次酸大规模工业生产。

发明内容

本发明基于本领域客观存在的上述疑难和需求，开发得到一种比原始野生酶表达量、稳定性、催化效率高出数倍、且底物转化率和目标产物得率均十分突出的重组酶，可用于工业上大规模生产甘草次酸。

本发明的技术方案如下：