[发明专利]一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用

说明书

本发明提供了一种高稳定性的免洗SNAP‑tag探针及其制备方法和应用，该探针基于4,5‑位双取代萘酰亚胺染料，以苄基鸟嘌呤为靶向基团，其结构式如(1)所示。该探针的4,5‑位的氮杂环丁烷结构很大程度上抑制了TICT(扭转的分子内电荷转移)的产生，使萘酰亚胺分子保持高稳定性的同时对极性变得不敏感。该探针在能够在2分钟完成(t_1/2＝8s)与SNAP‑tag的特异性结合，并在结合后实现8倍的荧光增强，实现了活细胞内对SNAP‑tag的免洗荧光成像。

技术领域

本发明属于荧光成像技术领域，具体涉及一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针及其制备方法和应用。

背景技术

由于具有尺寸小、荧光发射光谱宽泛、可选择荧光颜色多样等优点，有机小分子荧光染料在蛋白标记领域逐渐成为荧光蛋白的替代者。随着标签蛋白的出现，小分子荧光染料可以与融合有标签蛋白的目标蛋白发生专一的酶促共价连接反应，从而实现将小分子荧光染料特异性连接到目标蛋白。其中，应用最为广泛的标签蛋白为SNAP-tag，其能够与苄基鸟嘌呤(BG)与苄基氯嘧啶(CP)衍生物反应从而使SNAP-tag标记上人工合成的探针。

随着超分辨荧光成像技术的迅速发展，单分子下监测蛋白功能的行使以及分布成为了生物、医学等研究工作者的重要方向。借助SNAP-tag标签法与有机小分子荧光染料可以达到纳米尺度对目标蛋白的实时监测，但是这对SNAP-tag探针的设计提出了苛刻要求。首先，荧光染料分子需要保持高的光稳定性，防止强激光的淬灭效应；其次，SNAP-tag与探针结合后需要达到免洗荧光成像，才能够实现实时对活细胞内目标蛋白监测。然而，目前的商业SNAP-tag探针多数基于罗丹明及花菁类染料，与SNAP-tag蛋白结合前后荧光变化小，且罗丹明及花菁染料容易在线粒体聚集导致无法实现免洗成像。此外，花菁染料光稳定性差，很难达到长时间实时成像。因此，高稳定性、免洗的SNAP-tag探针的设计对于蛋白功能的研究具有重大意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种高稳定的性免洗SNAP-tag探针，该系列探针与SNAP-tag蛋白结合后荧光增强8倍，可实现活细胞内的免洗荧光成像。

本发明的另一目的是提供一种高稳定性免洗SNAP-tag探针的制备方法，该方法具有通用性，相比于目前嘌呤引入方法拥有步骤简单、易于提纯等优点。

本发明提供一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针，以萘酰亚胺为荧光团，通过4,5-位四元环结构的调节使萘酰亚胺的荧光稳定性、亮度大幅度提升，实现了SNAP-tag蛋白的免洗超分辨荧光成像。本探针荧光发射波长不随极性变化而变化，能够保持所采集荧光信号的准确性。

一种高稳定性的免洗SNAP-tag探针具有如下结构：

该探针基于4,5-位双取代萘酰亚胺染料，以苄基鸟嘌呤为靶向基团设计合成了，其结构式如(1)所示。该探针的4,5-位的氮杂环丁烷结构很大程度上抑制了TICT(扭转的分子内电荷转移)的产生，使萘酰亚胺分子保持高稳定性的同时对极性变得不敏感。

该探针在能够在2分钟完成(t_1/2＝8s)与与SNAP-tag的特异性结合，并在结合后实现8倍的荧光增强，实现了活细胞内对SNAP-tag的免洗荧光成像。

一种高稳定的性免洗SNAP-tag探针的合成路线，如下：

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-(4-羟甲基)苄基-4-溴-5-硝基-1,8-萘酰亚胺(BA-NBr)的合成：