[发明专利]一种同时检测特定DNA总量和单碱基突变量的生物传感器及其检测方法

权利要求书

1.一种同时检测DNA总量及其单碱基突变量的生物传感器，其特征在于，包括由以下方式制备得到的传感器界面：

将有5~7对碱基互补的抓捕链cDNA与修饰有信标分子的信标-抓捕链pcDNA杂交，得到一端为互补双螺旋、另一端为两条未配对长单链作为抓捕臂的“锚式”alDNA；将alDNA的双螺旋一端组装至电极表面，后封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附，得到传感器界面；

所述cDNA长28~ 30bp，能够与待测DNA形成长20 bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有巯基或氨基；pcDNA长21 ~ 23 bp，能够与待测DNA形成长16 bp以上的连续互补配对，其5’端修饰有磷酸基团，3’端修饰有电化学信号分子，电化学信号分子包括：亚甲基蓝、二茂铁或Cy5；

还包括：利用DNA连接酶进行DNA连接反应的试剂和DNA变性反应所需的试剂。

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，将alDNA滴加至含金电极、粗糙化金电极或电沉积有金纳米颗粒的玻碳电极表面，静置，使alDNA通过其末端的巯基或氨基经Au-S或Au-C共价键组装至电极表面。

3.根据权利要求2所述的生物传感器，其特征在于，将alDNA滴加至电极表面，静置14 h或过夜，然后将电极表面浸入6-巯基己醇溶液以封闭电极表面的空余位点以防止非特异性吸附物质干扰。

4.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，DNA连接反应的试剂组成为：30 mMTris-HCl，4 mM MgCl₂，10 mM (NH₄)₂SO₄，0.005% BSA，0.2 mM NAD和0.5 ~ 2 U/μL E. coli DNA连接酶。

5.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，DNA变性反应所需试剂组成为：50 %甲酰胺，10 mM 氯化钠或氯化钾，1 mM EDTA，10 mM pH 7.0的Tris。

6.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，所述cDNA碱基序列为：5’-TTTTCAACTAGGCACTCTTGCCTACGCCA-3’；所述pcDNA碱基序列为：5’-TCAGCTCCAACTACCAGTTGA-3’。

7.权利要求1-6任一项所述的生物传感器的检测方法，其特征在于，

将含待测序列的目标DNA溶液滴于电极表面与传感器体系进行杂交，此时检测电化学信号，可获得包括野生型W-DNA和突变型M-DNA之和的DNA总量对应的电流值；

突变型M-DNA含量的检测，继续向电极表面滴加DNA连接酶溶液，使捕获有M-DNA的传感体系中原cDNA的3’端与pcDNA的5’端发生特异性链接反应，而捕获有W-DNA的传感体系则不发生反应；再将电极表面浸入DNA变性反应溶液中定温水浴，通过DNA变性解旋使未直接连接在电极表面的所有DNA脱离传感体系，此时检测电化学信号，W-DNA体系无明显信号，可获得突变型M-DNA量对应的电流值。

8.根据权利要求7所述的生物传感器的检测方法，其特征在于，所述链接反应条件为38~ 40℃、0.5 ~ 1 h；所述DNA变性反应条件为40 ~ 42℃、30 ~ 45 min。