[发明专利]一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法

说明书

本发明公开了一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，通过将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上的ICP4基因启动子置换成结肠癌特异性启动子、再将I型单纯疱疹病毒17+株基因组上ICP34.5基因剔除并插入IL‑12表达序列，得到HSV^CEA+IL‑12。本发明提供了一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法，该新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL‑12采用CEA启动子及剔除ICP34.5的构建法实现高选择性地在结肠癌细胞内繁殖，确保该病毒不感染正常组织细胞；同时，插入IL‑12表达序列增强该新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL‑12的免疫调节作用，确保受损的结肠癌细胞被机体自身的免疫细胞彻底清除干净。

技术领域

本发明涉及生物技术和基因治疗领域，具体的说是涉及一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。

背景技术

溶瘤病毒疗法是一种利用病毒特异性地在肿瘤细胞中复制继而杀伤肿瘤细胞，并刺激机体产生特异性抗肿瘤免疫反应的新型肿瘤治疗方法。相比其他肿瘤治疗方法，溶瘤病毒疗法具有复制高效、杀伤效果好和毒副作用小等特点，已经成为肿瘤治疗研究领域的新热点。

美国Amgen公司的Ⅰ型单纯疱疹重组病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治疗晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期临床试验中显示出良好的肿瘤治疗效果，并成为首个获得美国FDA批准上市的溶瘤病毒类治疗药物。溶瘤病毒在黑色素瘤治疗上取得的成功引起了科学家对溶瘤病毒疗法更广泛的关注，溶瘤病毒的研究得到了进一步的推动。至今用于溶瘤治疗的病毒高达数十种，包括Ⅰ型单纯疱疹病毒(herpes simplexvirustype 1，HSV-1)、腺病毒、呼肠孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇病毒、麻疹病毒、人类免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicularstomatitis virus，VSV)和流感病毒等。溶瘤病毒按发展历程大致可分为4种类型：(1)野生型病毒株或自然减毒株，如新城疫病毒、柯萨奇病毒和呼肠孤病毒等；(2)基因工程选择性减毒株，主要是删除病毒某些关键基因而实现病毒复制的肿瘤选择性，如ONYX-015、G207等；(3)基因加载型病毒株，主要是在前述两种溶瘤病毒基础上加载外源治疗基因，如加载粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的JX-594和T-VEC等；(4)转录靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入组织或肿瘤特异性启动子来控制溶瘤病毒在肿瘤细胞内复制，如G92A等。

结肠癌是一种常见恶性肿瘤。癌胚抗原(Carcinoembryonic antigen，CEA)是一种主要在结肠癌细胞表达的分泌性蛋白，本发明利用结肠癌特异性表达CEA的特点构建选择性在结肠癌细胞感染繁殖的新型溶瘤病毒HSV^CEA+IL-12。该病毒不感染正常结肠粘膜细胞及其它正常组织，可静脉给药，具有高效、特异性强等优点。对血液中的循环结肠癌细胞及转移性结肠癌灶均有杀灭作用。

发明内容

为解决上述背景技术中提出的问题，本发明的目的在于提供一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒及其构建方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

本发明公开了一种选择性杀灭结肠癌细胞的新型溶瘤病毒构建方法，包括以下步骤：

步骤一、构建pdICP4-promoter质粒：PCR分别扩增I型单纯疱疹病毒17+株ICP4基因启动子上游和下游的侧翼序列后，用限制性内切酶EcoRI/SpeI分别消化后获得ICP4基因启动子的上游侧翼序列、下游侧翼序列及去除ICP4启动子的I型单纯疱疹病毒17+株，并用互补的连接酶Linker 1和Linker 2将所述ICP4基因启动子的上游侧翼序列和下游侧翼序列连接起来，并把连接后的产物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位点创建质粒pdICP4-promoter；