[发明专利]一种菊花内生真菌的分离提纯方法

权利要求书

1.一种菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：

选用健康的菊花植物进行采集，采集部位包括根、茎、叶和花；所述根和茎的长度为5cm以上，所述叶和花的面积为1.5cm以上×1cm以上

将准备好的菊花原材料均匀分成两份，得到叶和花的原材料一和根和茎的原材料二；

将所述原材料一去除边缘，裁剪成组织块，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的叶花样品一，将其存放无菌袋中于4℃保存叶花样品；

将所述菊花叶花样品以有效氯含量为10-15％的次氯酸钠水溶液浸泡3-4min，无菌水洗涤3-5次，再以体积百分比为70-75％的酒精水溶液浸泡1-1.5min，无菌水洗涤3-5次进行消毒；

将消毒后的叶花样品边缘部分去除，得到待分离菊花样品；

将所述待分离菊花样品平放于PDA基板中，将PDA基板放置在23±2℃的恒温培养箱中培养，制得培养基一；

待所述培养基一的组织边缘长菌后进行内生真菌分离纯化操作，制得菌落培养基；

将所述原材料二剪取嫩茎，并用清水冲洗晾干后，用无菌水对原材料二清洗2～4次，将样品边缘部分去除，内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，得到株茎样品；

将所述株茎样品在25℃黑暗条件下放入三角瓶中培养3-6天后，制得培养基二，并将所述培养基二置于预先准备好的恒温培养箱中培养；

将所述菌落培养基采用预先准备好的打孔器制得菌片，同时将所述菌片放置在所述培养基二中进行培养，并设置平行组和对照组；

根据所述平行组和所述对照组中有无菌丝的产生及菌丝的多少进行筛选分离操作；

将筛选分离后的培养基二长出真菌后，挑入斜面培养基中进行纯化培养，通过3～6次连续的菌丝尖端转移进行纯化，制得纯化后的内生真菌；

将得到的菊花内生真菌进行ITS测序鉴定，并在25℃黑暗条件下培养4-7天后，放无菌袋中于4℃保存。

2.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述组织块的长宽大小为0.5厘米*0.5厘米，并且，所述组织块的茎上含有2-3个侧芽。

3.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述菊花样品在消毒时依次采用75％的乙醇和0.1％的汞进行表面擦拭操作。

4.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述PDA基板在制作时，用电子秤称取预先准备好的去皮的土豆100克，煮沸30分钟，采用纱布过滤，并将过滤后的滤液进行加热，并加入琼脂7.5克，待琼脂完全融化后加入预先准备好的葡萄糖10克，待冷却后加入500毫升蒸馏水，制得所述PDA基板。

5.根据权利要求4所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述PDA基板在使用之前采用高温灭菌操作。

6.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述嫩茎在消毒时依次采用75％的乙醇表面擦拭1分钟和0.1％的汞表面擦拭7分钟操作。

7.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述培养基二置于所述恒温培养箱中培养时，其温度为23-25摄氏度，相对湿度为60％-70％，光照时间为12小时，光照强度开灯为1500-2500勒克斯或不开灯为200-500勒克斯。

8.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述打孔器的直径为0.45毫米，并且，所述打孔器在所述菌落培养基的表面选取菌落较多位置处进行打孔制得菌片。

9.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，所述平行组为四组，所述对照组为两组。

10.根据权利要求1所述的菊花内生真菌的分离提纯方法，其特征在于，当所述平行组产生少量菌丝时，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养基二中培养。