[发明专利]一类488nm激发的线粒体荧光探针及其制备与生物应用

说明书

本发明提供了一类488nm激发的线粒体探针及其制备和生物应用，该线粒体探针一定程度解决了该波段线粒体探针亮度低、稳定性差的问题。本发明涉及的488nm激发的线粒体探针以萘酰亚胺为母体，通过在萘酰亚胺4,5‑位引入不同刚性结构，抑制了扭转导致的能量损耗，提高了其亮度和稳定性，不同溶剂中荧光量子产率均大于0.80(水中Φ＝0.81)，摩尔消光系数大于40000M^‑1cm^‑1。同时降低了探针对pH、温度、极性等微环境的敏感度，保证了复杂的生理环境中荧光信号的准确性，可以实现对活细胞线粒体快速、准确地染色，在荧光显微成像领域具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明属于线粒体荧光探针领域，具体涉及一类488nm激发的线粒体探针及其制备和生物应用。

背景技术

线粒体是细胞生命活动的重要枢纽，随细胞的新陈代谢状态进行着不断的分裂、融合与重新分布，因此线粒体动力学的研究对理解细胞的生命状态有着重要意义。在众多研究工具中，荧光成像技术因其原位无损、快速灵敏的特点被广泛应用于这类生命过程的监测，而作为荧光成像与生命活动的媒介荧光探针的亮度、稳定性等参数直接影响着荧光成像质量。

目前应用最为广泛的488nm激发的线粒体探针为Mito Tracker Green。该染料以花菁染料为母体，极易被单线态氧进攻而发生荧光淬灭，亮度低、稳定性差。而随着超分辨荧光成像时代的到来，荧光染料的亮度和稳定性亟待跃升至新的高度以实现高功率激光下实时、准确地成像。因此，488nm激发的这类线粒体探针仍极为匮乏，开发此波段激发的高稳定性的线粒体探针显得尤其迫切。

发明内容

本发明的目的之一是提供一类488nm激发的高稳定性的线粒体探针，该类探针可对活细胞线粒体快速、准确标记。

本发明的另一目的是提供一类488nm激发的高稳定性的线粒体探针的制备方法，该方法具有步骤简单、容易分离、原料价廉等优点。

本发明提供一类488nm激发的高稳定性的线粒体探针，通过对萘酰亚胺分子内扭转的强力限制使分子达到荧光稳定性、亮度的大幅度提升，探针分子在水中量子产率可达0.80。

一类488nm激发的线粒体探针，该类线粒体荧光探针具有如下结构：

R₁，R₂分别为H，其中，若R₁为H，则R₂不为H；R₃为C1-4烷基；n为0-2整数。

一类488nm激发的线粒体探针的制备方法，此系列荧光探针合成路线，如下：

R₁，R₂分别为H，

其中，若R₁为H，则R₂不为H；R₃为C1-4烷基；n为0-2整数，R₄为

具体合成步骤如下：

(1)中间体N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：

将4,5-二取代-1,8-萘酰亚胺，胺基醇，溶于乙醇，升温至50-90℃，搅拌1-10h，减压蒸馏除去溶剂，残余物经硅胶柱分离得米白色固体N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐。

(2)中间体N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐的合成：

将N-羟烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐于乙酸乙酯，向其中滴加三溴化磷，缓慢升温至60-80℃搅拌4-12h，反应结束后减压除去溶剂，硅胶色谱柱分离得到N-溴烷基-4,5-二取代-1,8-萘酐。