[发明专利]非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法

说明书

非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法属生物技术领域，本发明包括：取样：将单头蓟马类昆虫从酒精溶液中取出；扎孔：用00号昆虫针对蓟马腹部刺穿；消化：将扎孔的标本放入装有消化液离心管中，置金水浴上孵育；标本回收：孵育结束后，吸取保留的虫体表皮至酒精溶液新的离心管中；DNA沉淀和吸附：在孵育好的消化液中加一定比例氯仿：异戊醇，吸取上清至新的无菌离心管中；漂洗：加入一定量的Buffer至过滤柱，室温离心，丢弃滤液；吹干；洗脱DNA。本发明非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA，所回收的凭证标本完整且提取的DNA纯度高，分类准确，能满足种类鉴定的需要。

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法。

背景技术

蓟马是缨翅目Thysanoptera昆虫的通称，是一个与人类关系密切的昆虫类群，其种类繁多，数量丰富，分布广泛。

蓟马个体较小，大部分种类体长0.5-5mm，蓟马种内还存在一定的形态变异，仅依靠传统的分类方法对其外部特征进行种类鉴定,无法满足实际工作的需要，而DNA提取技术是从核酸水平对蓟马类昆虫进行物种鉴定和物种起源、遗传及进化的探讨，进而解释物种多样性、系统发育及进化规律的，因此获取有效高质的DNA是进行昆虫种类分子鉴定，分子水平进化和系统发育研究所必需的条件,但多头提取昆虫DNA会掩盖个体的差异性,使得某些碱基突变无法识别,异种同型现象、近缘种的问题得不到有效解决；单头提取浓度小、质量低、连续片段短,无法满足高通量测序的要求；破坏性提取昆虫DNA，需要充分研磨样品,易造成人为污染,严重破坏样品的组织形态及结构,使得极少数的珍贵标本无法保留，即不能将基因序列与标本一一对应起来,影响了昆虫分类鉴定工作,尤其是一些害虫分类鉴定工作,致使微小型昆虫标本被错误鉴定分析屡见不鲜；传统非破坏性提取昆虫DNA,往往采用浸渍样本，使用有毒或腐蚀性化学品，需要过夜孵育而耗费时间，需要整头提取的虫体,特别是捕食性昆虫,要解剖捕食者以获取不受污染的组织切片,使得主要形态特征受损,不能作为完整个体继续保存,无法满足昆虫物种多样性快速、准确鉴定需要。

发明内容

我们非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法，标本无需研磨，只需在腹部扎孔的方式，经充分消化后，即可获得高质量的DNA模板。不但解决了破坏性提取的缺点，传统非破坏性提取的弊端，而且使得单头提取浓度大,质量高,连续片段长,满足了高通量测序的要求。

本发明的目的是提供一种非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法，该方法能够解决破坏性的提取蓟马DNA凭证标本无法保留和所获得的DNA浓度小、质量低、结构片段短、纯度不均一的问题，所提取的蓟马DNA浓度大、质量高、纯度均一、结构片段完整，且凭证标本虫体完整，主要特征清晰可辩，能够达到形态分类学与分子系统学两学科同步进行种类分子鉴定，发现新种、新记录及隐存种，探求物种之间的系统发育及进化关系等。

1.一种非破坏性从单头蓟马类昆虫标本中高效提取DNA的方法包括下列步骤：

1.1取样：将单头蓟马类昆虫从75％的酒精溶液中取出，在干净滤纸上放置30s，用镊子将标本转移至载玻片上，再将载玻片放置在解剖镜的视野中央；

1.2扎孔：将单头蓟马类昆虫的腹部朝上，用无菌的00号昆虫针对蓟马的腹部刺穿4～6下，其中第I腹节除外；

1.3消化：将扎孔的单头蓟马类昆虫放入装有250～350ul消化液和20～25ul蛋白酶K的1.5ml离心管，再将离心管放入金水浴上孵育3～4小时；

1.4标本回收：孵育结束后，吸取保留的虫体表皮至50％～75％酒精溶液新的1.5ml离心管中，进行后续的玻片制作；