[发明专利]一种埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白及其制备方法

说明书

本发明公开了一种埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白及其制备方法。本发明首次采用生物素标记埃博霉素生物合成基因启动子P3钓取的方法获得So ce M4埃博霉素生物合成基因簇的转录调控蛋白，并采用EMSA实验验该转录调控蛋白的功能。所得新型埃博霉素生物合成基因簇转录调控蛋白可为纤维堆囊菌埃博霉素生物合成转录调控及埃博霉素生物合成基因簇的异源表达奠定分子生物学基础，从而促进埃博霉素的高效生物合成及埃博霉素在生物医药方面的广泛应用。

技术领域：

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白及其制备方法。

背景技术：

纤维堆囊菌是一种次级代谢产物种类丰富的粘细菌，埃博霉素就是一类由纤维堆囊菌产生的具有广谱高效抗肿瘤活性的十六元大环内酯类化合物。埃博霉素由于其较好的水溶性、较低的副作用、更广谱的抗肿瘤活性及对耐药性肿瘤细胞良好的抗肿瘤活性，成为最有望取代紫杉醇的化合物。目前埃博霉素衍生物伊莎匹隆已经被批准用于临床治疗晚期乳腺癌，取得了很好的疗效。而且埃博霉素B和埃博霉素D也已经用于临床实验但由于埃博霉素产量较低，价格较昂贵，因此限制了其广泛应用。通过纤维堆囊菌埃博霉素转录调控蛋白的过表达，可以有效提高埃博霉素的产量，纤维堆囊菌So ce90、So 0157-2的埃博霉素生物合成基因簇已经鉴定，但目前关于纤维堆囊菌埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白的报道较少。本实验室从土壤中分离得到了一株产埃博霉素纤维堆囊菌，获得了埃博霉素生物合成基因启动子P3并进行功能验证，本实验采用生物素对该启动子P3进行生物素标记，然后采用链霉亲和素磁珠固定标记的启动子，然后从本实验室自主获得的纤维堆囊菌So ceM4的总蛋白中钓取启动子P3的结合蛋白，然后采用EMSA进行体外活性功能验证，为纤维堆囊菌埃博霉素的生物合成转录调控奠定基础。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种纤维堆囊菌So ce M4埃博霉素生物合成基因新型转录调控蛋白。

本发明的埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白，其特征在于，所述的埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白是产埃博霉素的微生物的总蛋白中与启动子P3结合的蛋白，所述的启动子P3的核苷酸序列为：5'-TGCGATCTTGTGATTCCCCTTCTGATCTTTAAAATTTCCCGATCCCCCAT-3'，具体序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的产埃博霉素的微生物是纤维堆囊菌So ce M4、纤维堆囊菌So ce 90、纤维堆囊菌So0157-2或纤维堆囊菌SMP44。

本发明的第二个目的是提供一种埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白的制备方法，其特征在于，是将产埃博霉素的微生物的总蛋白与启动子P3混合，选取能与启动子P3结合的蛋白。

优选，是通过生物素标记启动子P3，然后通过链霉亲和素磁珠固定生物素标记的启动子P3，提取产埃博霉素的微生物的总蛋白，将总蛋白加入固定启动子P3的链霉亲和素磁珠中，从中获得能与启动子P3结合的埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白。

所述的产埃博霉素的微生物是纤维堆囊菌So ce M4、纤维堆囊菌So ce 90、纤维堆囊菌So0157-2或纤维堆囊菌SMP44。

所述的生物素标记试剂盒购买自碧云天生物科技有限公司。链霉亲和素磁珠购买自百迈格生物科技有限公司(无锡，中国)。具体埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白获得步骤为：将通过Terminal Deoxynucleotidyl Transferase(TdT)把生物素标记的dUTP添加到启动子P3的3'末端。然后将生物素标记的P3启动子取少量加入到偶联了链霉亲和素的磁珠中，用磁力架固定磁珠，弃去上清，加入纤维堆囊菌So ce M4的总蛋白(4mg/mL)，用10mMEDTA pH 8.2和95％甲酰胺进行洗脱，从而获得埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白，将所得调控蛋白进行SDS-PAGE鉴定，并切割条带送至辉骏生物技术有限公司(广州，中国)进行氨基酸测序，从而获得埃博霉素生物合成基因转录调控蛋白的序列。