[发明专利]一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法

说明书

本发明涉及一种植物转基因技术领域，特别涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。通过超声波处理种子获得萌动种子、含目的基因农杆菌的培养、侵染种子与共培养、脱菌与选择培养和转基因植株分子检测的步骤，获得转基因植株。使用本发明方法可有效缩短转基因转化的时间，同时提高农杆菌介导的玉米遗传转化的效率。

【技术领域】

本发明涉及植物转基因技术领域，具体涉及一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法。

【背景技术】

玉米是禾本科玉蜀黍属一年生单子叶草本植物，是世界上重要的粮食作物之一。随着世界人口的增长和人们生活水平的不断提高，对玉米品种和质量提出了更高的要求。同时，随着国外种业不断涌入市场，国家对种植业结构的调整，各种生物因素和非生物因素的影响，导致玉米面积大减产。为改善玉米品质以确保国家粮食安全、满足人民更高质量的需求，提高市场竞争力，为新能源发展提供支撑，通过遗传改良来选育高产、高抗、优质玉米新品种，将成为解决这些问题的关键，同时也是未来玉米育种的重点发展方向。

单纯的传统育种手段，已暴露出缺点：育种周期长，育种效率较低，且对杂交后代表现型难以预测，已经很难发展满足需求，通过分子育种技术与传统育种技术相结合，来提高玉米的产量和质量已成为今后主要的发展趋势。转基因技术是通过分子生物学手段将目的基因转到受体材料中，在短时间内获得所需的生物性状。它具有定向选择、改善目标性状高效、精准的特点，可以缩短育种时间，能在一定程度上加快玉米选育。

随着越来越多玉米优良基因的发现，转基因育种技术逐渐在玉米育种中发展起来。目前，玉米上常用遗产转化方法分为DNA直接导入法和和农杆菌介导的转化法。DNA直接导入法主要包括PEG介导的转化法、电击转化法、基因枪转化法和花粉管通道转化法。其中PEG法和电穿孔法以原生质体为受体，由于对原生质体再生的依赖而在应用上受到很大限制。基因枪法虽然受体广泛，转化率较高，但外源DNA的整合方式复杂，常常是多拷贝插入，较易出现转基因沉默现象，转化的外源基因片断不能太大(上限是16-20kb)，转入基因的分离有时呈非孟德尔遗传等。同DNA直接导入法相比，农杆菌介导的转化法不需要原生质体的培养，培育周期短，技术较成熟，可以转化较大的外源基因片段，外源基因重排少，且以单拷贝或低拷贝插入受体细胞，稳定性好，可利用不同的启动子控制目的基因在特定的器官进行差异表达，较少出现沉默现象的优点。

农杆菌的侵染具有趋化性，一般只侵染双子叶植物和裸子植物，对单子叶植物没有感染力。近年来，虽然农杆菌的介导转化在一些单子叶植物上成功转化，但转化率仍然不高，此外，由于采用植物外植体(如幼胚、愈伤组织、茎尖等)作为侵染材料，后期需经过组织培养技术才能培育成再生植株，因此整个实验周期较长。目前，也有对此方法进行改进的，如专利20121012184.1《一种玉米遗传转化的方法》，通过对玉米种子整体进行侵染，后期采用农杆菌侵染的种子直接生根发芽成完整植株，从而获得成功转化的植株。虽然该方法在一定程度上，缩短了玉米遗传转化的时间，但由于种子外部拥有坚硬的种皮保护，侵染效率不高，因此获得的遗传转化效率并不高。

【发明内容】

鉴于上述内容，有必要发明一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，在缩短遗传转化时间的同时，提高玉米转基因转化率，将有较大的应用价值。为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种提高农杆菌介导的玉米遗传转化效率的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)种子的处理：玉米种子用体积浓度为45～55％的次氯酸钠溶液浸泡消毒5～15min后，用无菌蒸馏水清洗2～3次，用无菌滤纸吸干种子表面水分，将种子放入种子培养液中，于40℃～55℃下黑暗中超声波处理后，静置10～20min，捞出种子，放入40℃～55℃热水中浸泡30～50min，得到萌动种子；