[发明专利]一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法

说明书

本发明提供了一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，包括如下步骤：（1）多主棒孢对潮霉素的敏感性测定；（2）抗生素抑制农杆菌正常生长的浓度筛选；（3）多主棒孢分生孢子悬浮液制备；（4）含双元载体根癌农杆菌菌液制备；（5）根癌农杆菌与多主棒孢分生孢子共培养；（6）转化子的筛选；（7）转化子的分子鉴定，插入拷贝数以及遗传稳定性分析。本发明不需要去除真菌细胞壁制备原生质体，操作简单，转化效率高，并且得到的转化子单拷贝比例大，能够稳定遗传。本发明提供了一套稳定高效的根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，为获得致病突变体提供潜在可能，为深入研究致病相关基因及致病机制奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，属于基因工程领域。

背景技术

多主棒孢是一种重要的植物病原菌，寄主范围广泛。该病原菌常常危害植物叶部形成靶状病斑，也可侵染寄主的花、果实、茎和根。然而，有关多主棒孢致病遗传机制仍不清楚，鉴于多主棒孢叶斑病在作物上的经济重要性，发展新的策略，提供新的方法，在分子水平上深入研究致病相关基因和致病机制势在必行。

真菌转化技术以随机或靶向模式破坏基因而产生突变体，这为在分子水平上深入研究真菌致病相关基因提供了突变体材料。目前丝状真菌中使用最多的遗传转化方法有原生质体介导的遗传转化（PEG），限制性内切酶介导的遗传转化（REMI）以及根癌农杆菌介导的遗传转化（ATMT）。在这些转化方法中，因为ATMT技术避免了PEG和REMI转化技术的一些缺点而着渐成为真菌中研究基因功能的重要方法。首先，ATMT技术与PEG技术不同，不需要去除真菌细胞壁制备原生质体，而原生质体的制备是一个复杂的过程。ATMT技术优于其他转化方法的第二个突出特点是，T-DNA可以随机的插入到基因组中且通常以单拷贝插入的形式整合到基因组中，所以，任何一个表型改变的突变体都很可能是由于插入引起的。通过筛选T-DNA插入突变体库，获得表型突变体，然后扩增T-DNA插入位点侧翼序列，辨别受影响的基因。

目前有很多关于ATMT 在不同真菌中成功转化的例子，并且也证实该转化技术在靶标基因的删除和破坏方面非常有效。然而，不同真菌遗传转化所需的条件不同，转化参数存在差异，影响因素有所不同。到目前为止，没有关于根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化研究的报道，参照其他丝状真菌的转化方法无法顺利进行转化。

发明内容

本发明的目的是提供一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，通过该方法可得到T-DNA插入菌株，可以通过筛选T-DNA插入突变体库，获得表型突变体，再对其进行致病性试验，评价其致病能力。对致病能力变异的突变体研究其T-DNA插入拷贝数，扩增插入位点侧翼序列，再通过相关数据库及分子生物学软件来辨别受影响的基因。本发明为获得致病突变体提供潜在可能，为深入研究致病基因及致病机制奠定基础。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种根癌农杆菌介导的多主棒孢遗传转化方法，包括以下步骤：

（1）多主棒孢对潮霉素的敏感性测定：在含不同浓度潮霉素的PDA平板上接种多主棒孢，培养观察菌落生长情况，确定潮霉素（hph）最佳使用浓度；

（2）抗生素抑制根癌农杆菌正常生长的浓度筛选：挑取农杆菌单克隆活化扩大培养后，收集菌体稀释均匀涂布于含不同浓度头孢霉素和特美汀的平板上，培养观察，确定抗生素最佳使用浓度；

（3）多主棒孢分生孢子悬浮液制备：用诱导培养基洗脱平板上的多主棒孢分生孢子，调节孢子浓度为1×10^5-6 个/ mL；

（4）含双元载体根癌农杆菌菌液制备：挑取农杆菌单克隆活化培养后，用诱导培养基稀释，再培养5～6h使得OD₆₀₀达到0.5～0.6；