[发明专利]一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体及其构建方法有效
| 申请号： | 201811532914.7 | 申请日： | 2018-12-14 |
| 公开（公告）号： | CN109576305B | 公开（公告）日： | 2020-10-23 |
| 发明（设计）人： | 刘莉铭;古勤生 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院郑州果树研究所 |
| 主分类号： | C12N15/86 | 分类号： | C12N15/86;C12N15/65;C12N15/66 |
| 代理公司： | 郑州红元帅专利代理事务所(普通合伙) 41117 | 代理人： | 杨妙琴 |
| 地址： | 450009*** | 国省代码： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 携带 增强 绿色 荧光 蛋白 报告 基因 南瓜 花叶 病毒 重组 载体 及其 构建 方法 | ||
1.一种携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体，其保藏号为CGMCC No. 13940，于2018年11月22日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。
2.一种权利要求1所述的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，其特征在于：
（1）以侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计含有MP、LCP部分序列的多克隆位点，并进行基因合成，其序列如下：SEQ ID NO.1；
（2）以（1）、增强型绿色荧光蛋白报告基因（EGFP）和侵染性克隆pSqMV-RNA2的序列为基础，设计三对引物，其序列如下：
S2-1557-F：SEQ ID NO.2；
S2-1557-R：SEQ ID NO.3；
S2-1607-F：SEQ ID NO.4；
S2-1607-R：SEQ ID NO.5；
EGFP-F：SEQ ID NO.6；
EGFP-R：SEQ ID NO.7；
（3）以侵染性克隆pSqMV-RNA2为模板，利用引物S2-1607-F/ S2-1557-R进行扩增，获得长度为7990 bp的片段，以MP-MCS-LCP为模板，利用引物S2-1557-F/ S2-1607-R进行扩增，获得长度为110 bp的片段，利用同源重组方式将这两个片段进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA2-MCS；
（4）以pCambia3301-EGFP为模板，利用引物EGFP-F/ EGFP-R进行扩增，获得长度为757bp的片段，利用同源重组方式将该片段与经Sal I单酶切处理的pSqMV-RNA2-MCS进行连接，并将其转入大肠杆菌中，获得pSqMV-RNA2-EGFP，即为保藏号为CGMCC No. 13940的携带增强型绿色荧光蛋白报告基因的南瓜花叶病毒重组载体。
3.根据权利要求2所述的南瓜花叶病毒侵染性克隆载体的构建方法，特征在于：将所述的重组载体pSqMV-RNA2-EGFP采用液氮冻融法导入农杆菌菌株 GV3101。
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