[发明专利]稳定期特异性启动子及其应用

说明书

本发明提供30个稳定期特异性启动子(序列如SEQ ID NO:1‑30所示)及其应用。本发明提供的稳定期诱导的启动子主要集中在菌体生长稳定期启动重组表达，这对于发酵生产具有很重要的意义，特别是在发酵生产对宿主细胞有毒性的产品等。在发酵过程中，在稳定期时才会启动表达，避免了因宿主细胞受到毒害而导致减产。本发明为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供有力的技术支持。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种稳定期特异性启动子序列及其应用。

背景技术

赖氨酸脱羧酶(lysine decarboxylase,简称LDC,分类号为EC 4.1.1.18)广泛存在于微生物、动物和高等植物中，其可以将L-赖氨酸脱去一个羧基生成1,5-戊二胺(尸胺)和CO₂。1,5-戊二胺的用途相当广泛，例如可以和二元酸进行聚合反应合成新型尼龙，在工业生产中具有很高的应用价值。目前，微生物法戊二胺生产主要采用微生物发酵生产和微生物体外酶催化生产戊二胺。

利用微生物发酵生产或微生物体外酶催化生产1,5-戊二胺时，使用较多的是根据乳糖操纵子来构建赖氨酸脱羧酶基因表达盒，CN105441497A中通过构建结构为LacIq-IPTG/乳糖诱导型启动子(Ptac)-信号肽-赖氨酸脱羧酶基因-终止子的表达盒，使得赖氨酸脱羧酶基因分泌表达。而使用这种方法在大规模工业生产时需额外添加乳糖，增加了生产成本。

研究人员发现原核生物体内自然存在着一些启动子是当菌体生长到稳定期后才会启动下游基因的表达的，称为稳定期诱导的启动子，或称稳定期特异性启动子，如csiE，bolA，osmY，katE等。除此之外，还需进一步开发在稳定期特异性诱导的且能够高水平驱动目的基因表达的新型启动子。

发明内容

本发明的目的是提供稳定期特异性启动子及其应用。

本发明的另一目的是提供一步法发酵生产1,5-戊二胺的方法。

为了实现本发明目的，本发明人提供的稳定期诱导的启动子能够在稳定期利用微生物大量表达异源蛋白，为利用微生物表达对菌体生长产生毒性的蛋白提供技术支持。进一步地，为了实现一步法发酵生产1,5-戊二胺，将编码赖氨酸脱羧酶的基因构建至具有生产L-赖氨酸能力的菌株中。考虑到若赖氨酸脱羧酶和赖氨酸同时表达，生成的具有毒性的1,5-戊二胺会影响细胞生长。于是采用稳定期启动子，以使菌株先发酵生产赖氨酸，进入稳定期后再发酵生产赖氨酸脱羧酶，减少产物1,5-戊二胺对菌体生长的不利影响。

第一方面，本发明提供的稳定期特异性启动子，所述启动子的大小为37-45bp，至少包括-10区、RNA聚合酶б^s特异性识别位点和-35区；

其中，将所述启动子序列的3’末端碱基对应于下游基因转录起始位点的位置记为-1位，所述-10区位于-12～-7位，碱基组成为5’-TATACT-3’；

所述启动子序列的-13位碱基为C；

所述RNA聚合酶б^s特异性识别位点位于-18～-14位，碱基组成为5’-TTGTT-3’；

所述-35区的碱基组成为5’-TCCCGCC-3’或5’-TCCCGAC-3’，且所述-35区和-10区之间间隔的碱基数为15-20bp。

进一步地，所述稳定期特异性启动子的序列为：

i)SEQ ID NO:1-30任一所示的核苷酸序列；或

ii)SEQ ID NO:1-30任一所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且以稳定期特异性方式显示出启动子活性的核苷酸序列；或