[发明专利]一种检测低丰度突变序列的核酸扩增阻断剂及应用

说明书

本发明公开了一种检测低丰度突变序列的核酸扩增阻断剂的设计原则，涉及突变基因的检测领域，所述核酸扩增阻断剂为锁核酸(LNA)修饰的寡核苷酸，所述核酸扩增阻断剂配对区域位于扩增序列之间，并与野生型基因序列完全配对，与突变序列至少存在一个错配。本发明还公开了该核酸扩增阻断剂在检测低丰度突变序列中的应用。本发明通过LNA修饰的核酸扩增阻断剂与突变核酸序列/野生型核酸序列的亲和力存在巨大差异，从而达到高选择性的扩增/富集样本中突变序列的目的，该类核酸阻断剂具有亲和性高、碱基修饰位置灵活、热稳定性好、价格低廉等优点，本发明对缺失突变、插入突变的检测效果更显著。

技术领域

本发明涉及突变基因的检测领域，尤其涉及一种低丰度突变序列的核酸扩增阻断剂的设计原则及其应用。

背景技术

基因突变是由于DNA分子中发生碱基对的增添、缺失或者改变而引起的基因结构的改变。而基因突变与很多的疾病症状相关，如肿瘤患者组织和外周血内含有少量的肿瘤循环DNA、初期出现的细菌和病毒耐药情况等，因此突变基因可以作为疾病发病、预后判断以及用药指导的标志物。而基于核酸扩增是突变基因检测最为常见的一种手段。

核酸扩增是大多数核酸测定法中的基本步骤。核酸的准确检测通常是指在过量的非靶标核酸存在下扩增特定靶标核酸的能力，所述的非靶标核酸是指具有与靶标核酸相似的序列。在一些情况下，非靶标核酸与靶标核酸相差少到一个核苷酸(或者一个核苷酸碱基对)。例如在肿瘤检测以及个性化治疗的时候，需要在过量的非变异序列中灵敏可信地检测痕量与肿瘤相关的突变等位基因，这对于早期或确认诊断、治疗决定、疾病监测和预后来说都是必不可少的。然而，如何在大量野生非靶向等位基因背景下高灵敏和高特异地对突变序列进行检测仍然具有很大的挑战性。

目前检测少量基因突变的方法主要有直接测序法、传统的荧光定量PCR法和高分辨率溶解曲线法。这些方法在突变基因检测灵敏度和检测通量上均存在一定的不足。

Sanger基因测序法：先针对突变位点设计相应的引物，然后通过PCR扩增获得目的基因产物，最后对PCR产物进行测序，并对测序结果进行分析。测序法的灵敏度低，只能对含量超过20％的基因突变进行检测。因此方法不适合在临床上应用于大量临床样本的分析。

变性高效液相色谱法：该方法的原理是基于发生错配的杂合双链与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将两者分开。由于杂合双链在突变位点出现了错配，更易于形成特殊的结构，与固相的结合能力降低，因此杂合链要比纯合链更优先洗脱出来，通过洗脱峰的不同判断有无突变的存在。但是该方法仪器昂贵，对仪器设备和操作人员的专业熟练水平有很高的要求。同时在检测时，对样本的纯度要求比较高，还存在灵敏度不足的问题(上样量要大于0.01ng)。

高分辨率溶解曲线(申请号CN104762408B)：基于核酸的物理性质，通过饱和染料结合于PCR扩增产物，监控产物溶解曲线的变化分析基因突变。检测敏感性在5％左右，对于阳性结果并不能确定其具体位置，最终需要通过测序法加以确认。

探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system,ARMS)(申请号CN101608240B/CN102747157A)：利用PCR引物的3末端碱基必须与模板互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，进而达到检测突变的目的。ARMS法简单省时，但是需要事前知道突变的类型才能检测，并且在野生模版浓度较高时，容易产生假阳性的结果，另外，这个方法的检测灵敏度通常也仅能到1％左右。

Taqman错配扩增突变：在该方法中，将错配序列引入到探针中，并且在存在突变序列的情况下才检测扩增信号。但是这种方法，如果野生模版浓度过高的时候，容易产生假阳性的结果。同时，在获得阴性结果的情况下，突变的鉴定需要另外的测定，因此该方法是不充分的。