[发明专利]用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法

权利要求书

1.一种用于驴的个体识别和亲子鉴定的微卫星快速检测方法，其特征在于：包括提取驴的DNA并检测、确定驴的13对微卫星位点并合成微卫星引物、PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物及检测结果分析步骤；所述驴的13对微卫星点位及产物大小范围分别为：

微卫星点位AHT4，引物序列F:AACCGCCTGAGCAAGGAAGT，R:GCTCCCAGAGAGTTTACCCT；产物范围126-162bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；

微卫星点位HMS7，引物序列F:GCAGTCCTGTGTACCCTTCA，R:GGTAGATACATGAACCCAGACG；产物范围212-220bp，引物终浓度63.3nM/L，携带标记为FAM；

微卫星点位HTG7，引物序列F:GGATGTGAACCCAACTTTATGAG，R:GCAGAGCTGCTACACGGACT；产物范围279-299bp，引物终浓度110nM/L，携带标记为FAM；

微卫星点位ASB23，引物序列F:GCCTTTATCTCCCCTTTTCAAC，R:GAAAGTCTTGGTTTTGGCATTG；产物范围361-379bp，引物终浓度146.7nM/L，携带标记为FAM；

微卫星点位HMS3，引物序列F:TCAGATAGTGATAATGCCGTGG，R:GCTCTAAAGCCCCAACTCTTTG；产物范围444-456bp，引物终浓度96.7nM/L，携带标记为FAM；

微卫星点位HTG10，引物序列F:TGGGCTTTTTATTCTGATCTGTC，R:AGTTTATTACAAATGGCCAATTCC；产物范围111-133bp，引物终浓度300nM/L，携带标记为HEX；

微卫星点位TKY312，引物序列F:TGTCTGCACTCTTAAGCTCAT，R:TAATGCTTTCCAGGTTCATC；产物范围200-208bp，引物终浓度233.3nM/L，携带标记为HEX；

微卫星点位HMS2，引物序列F:GATCTCTAGCTCAGTAAATCACAGG，R:ACGGTGGCAACTGCCAAGGAAG；产物范围308-328bp，引物终浓度80nM/L，携带标记为HEX；

微卫星点位TKY297，引物序列F:CCTGGCTCTAGGAGATTCCA，R:AGGCTTGGTGTATTCAACCTACTC；产物范围405-429bp，引物终浓度76.7nM/L，携带标记为HEX；

微卫星点位HMS6，引物序列F:AGGTGAGACGCACTTCTGTTATCAG，R:GTCATTCCCTGCATTTCATCACTAA；产物范围481-497bp，引物终浓度93.3nM/L，携带标记为HEX；

微卫星点位HMS18，引物序列F:CAACAATGAAAATTTGTCCTGTGC，R:GTAAATGAGTAGACAATCATGAGG；产物范围174-192bp，引物终浓度130nM/L，携带标记为TAMARA；

微卫星点位TKY343，引物序列F:GCCTCTCCAGATAGTCCCTA，R:CCAAAGGTCACCAGATAATTG；产物范围256-262bp，引物终浓度366.7nM/L，携带标记为TAMARA；

微卫星点位TKY337，引物序列F:GCTAATGCAGCACAGCTTGT，R:ATGAATAAGGGATGTGACATTAGTC；产物范围375-387bp，引物终浓度240nM/L，携带标记为TAMARA；

所述13对微卫星引物的退火温度相差小于等于2℃；

所述PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物，按照如下步骤进行：

驴的微卫星13重PCR扩增：使用上述微卫星引物合成13对荧光引物，按照各自确定的引物终浓度配成引物混合液加入反应体系，反应体系为15ul：引物混合液6ul、DNA聚合酶7.5ul、待测驴的DNA 1～50ng，加灭菌水补齐至15ul；PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，退火温度58.5℃30秒，72℃延伸1分钟，共30个循环；72℃延伸20分钟；4℃保持；通过一次PCR扩增得到13条目标微卫星序列产物；

使用ABI 3730xl测序仪和Genemapper v4.0软件检测上述PCR产物，获得待测样品在13个微卫星位点上的基因分型；对比两个样本的13个微卫星位点的基因型，如果完全一致，判断为同一个体，反之不是同一个体；对比待测样本与亲本的13个微卫星位点的基因分型，根据等位基因的遗传定律判断二者的亲子关系。