[发明专利]一种产十八碳四烯酸卷枝毛霉细胞工厂的构建及其发酵技术

说明书

本发明涉及一种产十八碳四烯酸SDA卷枝毛霉细胞工厂的构建及其发酵技术，属于基因工程领域，本发明从高山被孢霉克隆获得Δ15 Des基因，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将Δ15 Des整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑Δ15，最终实现了Δ15Des基因在卷枝毛霉中的表达，重组菌株Mc‑Δ15中油脂含量与对照菌Mc1552相比无显著差异，然而其油脂组成变化较大，而且在表达菌株Mc‑Δ15油脂中出现SDA，其含量达到总脂肪酸的5.2%。优化发酵条件并添加前体脂肪酸情况下，SDA含量达8.3%。重组新菌种于2018年6月20日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏中心给予该生物材料的保藏号为CGMCC No.15888，建议的分类命名Mucor circinelloides‑D15D。

技术领域

本发明涉及一种产十八碳四烯酸卷枝毛霉细胞工厂的构建及其发酵技术，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术在卷枝毛霉中异源表达Δ15 脱饱和酶（Δ15 Des），构建能够产十八碳四烯酸的细胞工厂。

背景技术

细胞中积累油脂在20%以上的微生物被称为产油微生物，包括细菌、真菌、酵母和微藻。在产脂真菌中，卷枝毛霉在上世纪80年代被用来工业化生产亚麻酸，由于其产脂能力强，基因组已被测序，基因研究体系完善而被用来作为研究微生物生产亚麻酸的模式生物。

由于多不饱和脂肪酸（PUFAs）对人体营养与健康方面有诸多益处而得到越来越多的人的重视。哺乳动物，包括人类，在体内只能合成饱和脂肪酸(SAFA)和单不饱和脂肪酸，(MUFA)，而ω-6 和ω-3系列多不饱和脂肪酸如亚油酸（LA, 18:2, n-6)）和α-亚麻酸(ALA,18:3, n-3) 不能在体内合成。因此，多不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸，只能通过饮食获得。亚油酸和亚麻酸经过多种酶催化后可用于合成二十二碳五烯酸 (DPA, 22:5, n-6)和二十二碳六烯酸（DHA, 22:5, n-3）。经研究发现，多种疾病的发生，如肥胖、高血压、糖尿病、冠状动脉硬化、精神分裂症及老年痴呆与必需脂肪酸的代谢有关。因此，必需脂肪酸及其衍生物对于人类的健康在生理学和病理学方面具有重要意义。

十八碳四烯酸SDA (18:4n-3)是由Δ6脱饱和酶催化α-亚麻酸ALA (18:3n-3)或Δ15 Des催化γ-亚麻酸(GLA，18:3, n-6)合成。在人体中，由ALA合成SDA能力非常有限，进而使得人体中通过膳食补充ALA用以增加人体二十碳五烯酸EPA（20:5n-3）的策略实际意义不大，然而EPA，被誉为“血管清道夫”，具有调节血脂、降低血液粘稠度，预防血栓形成；降血压，保护心脑血管健康及肾脏功能等重要生理意义，而SDA在体内容易转化为EPA。因此，通过膳食直接增加SDA，进而增加人体中EPA的合成量具有现实意义。在过去50年间，人们普遍认为增加膳食中ω-3类的脂肪酸，尤其是EPA和DHA可以预防多种心脑血管疾病发生的重要因素，而且EPA是前列腺素E3和白细胞三烯B5的前体物质。

高山被孢霉是另外一种产脂微生物，其油脂产量能达到细胞干重的50%，并且花生四烯酸（ARA）含量比较高，因此，高山被孢霉被用来工业化生产ARA。近几年，高山被孢霉中与产脂相关的基因研究较多，并且对其油脂合成路径进行了详细的研究。Δ15 Des能够催化GLA (18:3，n-6)生产SDA，因此该基因命名为Δ15 Des，该基因在高山被孢霉中是花生四烯酸生物合成的限速因子。然而，关于利用Δ15 Des的微生物表达生产SDA 的研究并不多见。

高山被孢霉产油量与多不饱和脂肪酸含量较高，但是其发酵成本较高，生物量低，限制其工业化应用。本研究室前期研究发现卷枝毛霉细胞内脂肪酸的组成中GLA含量为18-19%，胞内不含SDA ，但其发酵条件可控性高，生物量高。因此，本研究结合两个菌种的优势，将来源于高山被孢霉的Δ15 Des，通过同源重组的基因工程方法来在卷枝毛霉中进行表达，构建能够产SDA的细胞工厂，为大力推广卷枝毛霉的工业化应用生产SDA提供技术支持。

发明内容