[发明专利]一种产双高-γ-亚麻酸卷枝毛霉细胞工厂的构建方法及发酵技术

说明书

本发明涉及一种产双高‑γ‑亚麻酸卷枝毛霉细胞工厂的构建方法及发酵技术，属于基因工程领域，本发明从高山被孢霉克隆获得γ‑亚麻酸延长酶基因glelo，连接至整合型质粒pMAT1552上，转化到卷枝毛霉缺陷型菌株Mu402中，通过同源重组将glelo基因整合到卷枝毛霉的基因组上，得到重组菌株Mc‑glelo，最终实现了glelo基因在卷枝毛霉中的表达，重组菌株Mc‑glelo中油脂含量与对照菌Mc1552相比无显著差异，然而其油脂组成变化较大，而且在表达菌株Mc‑glelo油脂中出现双高‑γ‑亚麻酸（DGLA），其含量达到了总脂肪酸含量的5.7%。优化发酵条件并添加前体脂肪酸情况下，DGLA含量达7.6%。重组新菌种于2018年6月20日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心。保藏中心给予该生物材料的保藏号为CGMCC No.15887，建议的分类命名Mucor circinelloides‑GLELO。

技术领域

本发明涉及一种产双高-γ-亚麻酸卷枝毛霉细胞工厂的构建方法及发酵技术，属于基因工程领域。本发明通过同源重组技术在卷枝毛霉中表达来源于高山被孢霉中的γ-亚麻酸延长酶基因（glelo），构建能够产双高-γ-亚麻酸的细胞工厂。

由于多不饱和脂肪酸（PUFAs）对人体营养与健康方面有诸多益处而得到越来越多的人的重视。哺乳动物，包括人类，在体内只能合成饱和脂肪酸(SAFA)和单不饱和脂肪酸，(MUFA)，而ω-6和ω-3系列多不饱和脂肪酸如亚油酸（LA, 18:2, n-6)）和α-亚麻酸(ALA,18:3, n-3) 不能再体内合成。因此，多不饱和脂肪酸是人体必需脂肪酸，只能通过饮食获得。亚油酸和亚麻酸经过多种酶催化后可用于合成二十二碳五烯酸（DPA, 22:5, n-6）和二十二碳六烯酸（DHA, 22:5, n-3）。经研究发现，多种疾病的发生，如肥胖、高血压、糖尿病、冠状动脉硬化、精神分裂症及老年痴呆与必需脂肪酸的代谢有关。因此，必需脂肪酸及其衍生物对于人类的健康在生理学和病理学方面具有重要意义。

双高-γ-亚麻酸 (DGLA, 20:3, n-6) 是γ-亚麻酸（GLA, 18:3, n-6)）在Δ6延长酶的催化作用下合成的。双高-γ-亚麻酸具有重要的生理功能，它能够在氧化代谢中通过环氧合酶和脂肪合成酶催化生产具有抗炎功能的类花生酸类物质，如前列腺素E1和白细胞三烯E3等。同时，双高-γ-亚麻酸在Δ5脱饱和酶的作用下转化为花生四烯酸（AA, 20:4,n-6），而花生四烯酸是前列腺素E2和白细胞三烯B3的前体物质。

细胞中积累油脂在20%以上的微生物被称为产油微生物，包括细菌、真菌、酵母和微藻。在产脂真菌中，卷枝毛霉在上世纪80年代被用来工业化生产GLA，由于其产脂能力强，基因组已被测序，基因研究体系完善而被用来作为研究微生物生产GLA的模式生物。

高山被孢霉是另外一种产脂微生物，其油脂产量能达到细胞干重的50%，并且花生四烯酸含量比较高，因此，高山被孢霉被用来工业化生产花生四烯酸。近几年，高山被孢霉中与产脂相关的基因研究较多，而对其油脂合成路径进行了详细的研究。Δ6延长酶能够催化GLA (18:3n-6)延长为双高-γ-亚麻酸(20:3n-6)，因此该基因命名为γ-亚麻酸延长酶基因（glelo），该基因在高山被孢霉中是花生四烯酸生物合成的限速因子。然而，关于利用glelo的微生物表达生产双高-γ-亚麻酸 (DGLA, 20:3, n-6)的研究并不多见。