[发明专利]一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法

说明书

本发明公开了一种表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。将基因工程稻谷粉碎后与提取缓冲液混合提取后过滤，得到含重组人纤维连接蛋白的粗提液；将含重组人纤维连接蛋白的粗提液经过阳离子交换层析，进行初级分离纯化，获得含重组人纤维连接蛋白的初级产物；将初级产物经过阴离子交换层析，进行末级分离纯化，获得重组人纤维连接蛋白目标物。该方法成本低，易于工业化放大。所获得的OsrhFn目标物SEC‑HPLC纯度大于95％。生物活性较好。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法。

背景技术

纤维连接蛋白(Fibronectin，Fn)，也做纤维结合蛋白，是一种分布极为广泛的高分子量糖蛋白。存在于血浆、细胞胞内物质及不同细胞表面中，它通常以分子量为450kD左右的二聚体形式存在，单体分子量为220 -250kD，由位于蛋白质羧基端的二硫键相连。纤维连接蛋白大多以可溶的形式存在于血浆等体液中，以不可溶的形式存在于细胞外基质中。它具有与细胞外基质蛋白如胶原、循环血液蛋白如血纤蛋白、糖胺聚糖如肝素等物质的结合，因此，在很多重要的生理过程如胚胎发育、伤口愈合、止血和凝血中都发挥着重要的作用。

早期从组织中纯化Fn的方法多为冷沉淀法，Fn与一些杂蛋白在4℃以下静置时会以沉淀形式析出，之后再以沉淀和离子交换层析等方法进一步纯化；从培养纤维原表面分离Fn蛋白则采用低浓尿素的提取方法；而Anti-Fn介质则可广泛地应用于血浆及细胞培养物中Fn的纯化。但这些方法都逐渐以亲和层析所取代，原理是基于它与变性胶原蛋白(通常为明胶)的高特异亲和性的结合，然后以1mol L KBr、1 -8mol L尿素或胺盐洗脱。

纤维连接蛋白在血浆中的含量极为丰富，约为300mg/L，因此血浆是获得Fn的一个主要来源。国外生产的Fn产品都是从人血浆中提取的,作为化妆品添加剂并可用于药物中治疗创伤、烧伤、休克等，具有重大的社会效益及经济价值，但血浆来源有限，且生产工艺复杂，不利于规模化放大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从表达重组纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的层析方法。

为实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种从基因工程水稻种子中分离纯化重组人纤维连接蛋白的方法，依次包括以下步骤：

1)从重组人纤维连接蛋白的基因工程水稻种子中提取含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液；

2)将含有重组人纤维连接蛋白的粗提取液经阳离子交换层析，得到初级产物；

3)将初级产物经阴离子交换层析，得到纯化的重组人纤维连接蛋白。

步骤1)中以重组人纤维连接蛋白基因工程水稻种子为原料，将稻谷脱壳抛光成半精米，并研磨成80-100目的米粉；将所述米粉与提取缓冲液以重量/体积为1:5-1:10的比例混合，常温下提取0.5-2小时，获得粗蛋白提取物；所述提取缓冲液为：0-50mM Tris、0-50mMPB，0-110mM NaCl，pH 5.9-8.0；优选的提取组分中可添加0.8-1mM PMSF或5-10mM GSH或0.05-0.1％ Tween 80中的一种或数种。