[发明专利]一种体外发酵糖醇益生功能评价装置及方法

权利要求书

1.一种体外发酵糖醇益生功能评价装置，其特征在于，包括发酵装置和集气装置，发酵装置下部设有取样口，发酵装置和集气装置通过导管连通；发酵装置采用批式深层发酵，发酵装置通过导管向集气装置输送发酵气体，同时预先填充满氮气的集气装置向发酵装置输送氮气以维持厌氧环境。

2.根据权利要求1所述的体外发酵糖醇益生功能评价装置，其特征在于，发酵装置为具支试管，下部分支为取样口，具支试管配套有具支帽和塞子；集气装置为锥形瓶，锥形瓶配套有塞子。

3.利用权利要求2所述装置进行体外发酵糖醇益生功能评价方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、装置灭菌：将体外发酵糖醇益生功能评价装置所用的具支试管、具支帽、具支试管配套塞子、导管、1号锥形瓶、1号锥形瓶配套塞子灭菌；

步骤二、培养基配置：量取蒸馏水于2号锥形瓶中，按照如下培养基配方先称量相应比例组分A于2号锥形瓶中溶解，塞上塞子，灭菌；在无菌操作台中加入相应比例的组分B溶解混匀；空白组和待测糖醇组的各具支试管中各量取30mL培养基；

1L培养基配方：组分A：蛋白胨2.00g，酵母提取物2.00g，氯化钠0.10g，磷酸氢二钾0.04g，磷酸二氢钾0.04g，七水硫酸镁0.01g，六水氯化钙0.01g，碳酸氢钠2.00g，吐温802.00mL；组分B：血红素0.02g，维生素K1 10.00mL，三号胆盐0.50g，半胱氨酸盐酸盐0.50g；

步骤三、粘膜凝胶小球制备：称取1.1g琼脂或者0.5g结冷胶+0.6g瓜尔豆胶溶解于100mL蒸馏水中，灭菌，在无菌环境下加入1wt%的CaCl₂，转移到球形磨具中得到直径为5mm的凝胶小球；将凝胶小球浸泡于60±5℃粘液素琼脂溶液制成直径为7±0.2mm的粘膜凝胶小球；

步骤四、粪便预处理：称取新鲜粪便用pH6.8的磷酸盐缓冲液溶解，厌氧环境下纱布过滤掉固体颗粒，所得滤液即为菌液；

步骤五、接种培养：将步骤四得到的菌液以10%的接种量分别接种到步骤二中装有培养基的各支具支试管中，分别加入3~5个步骤三制备的粘膜凝胶小球，将具支试管和对应1号锥形瓶分别填充氮气后，分别塞上塞子，再用导管将两者连接起来，具支帽盖上，各个接口用封口膜密封后，置于37℃培养箱中培养；

步骤六、糖醇发酵：培养24h后，在待测糖醇组的具支试管中分别加入终浓度为9g/L的待测糖醇；再将具支试管和对应1号锥形瓶分别填充氮气后，分别塞上塞子，再用导管连接起来，各个接口用封口膜密封后，置于37℃培养箱中继续培养3天；

步骤七、益生效应评估：

（1）每天收集发酵液及1个粘膜凝胶小球，测定发酵液和粘膜中肠道微生物的组成及分布；

（2）检测发酵液中短链脂肪酸浓度，短链脂肪酸包括乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、戊酸盐；

（3）测定1号锥形瓶中发酵气体成分分布。

4.根据权利要求3所述的体外发酵糖醇益生功能评价方法，其特征在于，步骤三粘液素琼脂溶液由如下方法制备得到：称取0.1g琼脂于100mL蒸馏水中加热溶解，待琼脂溶液澄清透明后，称取0.5g粘液素趁热溶解，调节pH为6.8，冷却至60±5℃备用。

5.根据权利要求3所述的体外发酵糖醇益生功能评价方法，其特征在于，步骤四粪便预处理具体操作如下：配制0.01mol/L的NaH₂PO₄和0.01mol/L的Na₂HPO₄，两者按一定比例混合，配制成pH6.8的磷酸盐缓冲溶液，称取10g新鲜粪便用80mL磷酸盐缓冲液溶解，厌氧无菌环境下纱布过滤掉固体颗粒，所得滤液即为菌液。

6.根据权利要求3所述的体外发酵糖醇益生功能评价方法，其特征在于，步骤七用细菌DNA试剂盒提取基因组后通过16SrRNA扩增子高通量测序，测定发酵液和粘膜中肠道微生物的组成及分布。