[发明专利]一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法

说明书

本发明公开了一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法，其区分为正面和反面，包括，样品进样腔和油相进样腔；微流通道，样品自所述样品进样腔通过微流通道与自所述油相进样腔和微流通道汇流，制备液滴，并流至第一容置空间；第二容置空间，液滴自所述第一容置空间通过所述平铺腔进口流至所述第二容置空间内。本发明进行功能区分隔，在独立的区域内分别完成数字PCR的三环节，液滴制备，PCR扩增及平铺统计计数，在液滴的制备及扩增环节，微液滴处于自由状态，微液滴稳定性高，有效地保障了液滴的稳定性，数字PCR芯片使用过程中无开盖步骤，无交叉污染的风险，提高了数字PCR实施的成功率及时效性。

技术领域

本发明涉及生物反应的检测或分析等中使用的试样分析试管技术领域，特别是，涉及一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片及其使用方法。

背景技术

核酸是生命的最基本物质之一，任何疾病都能在核酸水平上找到证据。目前，核酸检测已被广泛应用于疾病研究、体外诊断、兽医、食品安全、生物安全、农业等领域。

当前核酸分子的定量检测有三种方法：光度法、实时荧光定量PCR以及数字PCR(Digital PCR，dPCR)技术。数字PCR技术是基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种核酸分子扩增及绝对定量的技术。该技术将稀释后的核酸溶液分散至大量的微反应器中，每个微反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR热循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会呈现荧光信号，没有模板的反应器就无荧光信号。在结果读出过程中，根据微反应腔荧光信号的相对比例，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

基于液滴微流控技术的液滴数字PCR，由于具备：更容易提供小体积、高通量的微反应器等优点，受到广泛地关注。液滴数字PCR反应分为三个环节：液滴制备、扩增及液滴计数统计。目前，具有代表性的液滴数字PCR系统有3款，分别是Bio-Rad公司的QX-100TM/QX-200TM、Raindance公司的Rain Drop TM以及Stilla technologies公司的Naica TM系统。

一体化芯片的技术路线，目前存在的问题主要是由于功能区域重合而造成的。目前无论是商品化的产品还是文献中报道的用于数字PCR的微流控芯片，其设计均将液滴收集、扩增反应和结果读出集中在同一区域，为了保证最终读数的准确性，现存方案均在液滴制备后就将制备的微液滴在扩增腔中平铺成一层，因为液滴计数是采用显微成像的方法，用数码相机对所有液滴进行拍照。只有液滴均匀的平铺成一层，才能够利用拍摄清楚的图像对最终的液滴数量进行精准计数。现有技术中，液滴扩增及扩增后液滴技术均在扩增腔中完成，这样就造成了种种限制：(a)油相(连续相)的选择提出了限制。因为需要保证在扩增过程及扩增之后，扩增腔中的微液滴均需维持平铺成一层的效果。但是，微液滴平铺成一层属于“亚稳态”。在这种状态下，微液滴的稳定性降低。同时，实现此状态对液滴的制备过程，需要选择特殊的油相加以克服，以提高微液滴的稳定性。(b)微液滴数目有限。芯片内液滴的数目越多，最终数字PCR的定量结果就越准确，而由于液滴扩增及结果统计均在扩增腔中完成。为了便于结果统计，微液滴需平铺成一层。这就对扩增腔内能容纳微液滴的数量提出了限制。(c)芯片制作材料的限制。目前为了保障(平铺成一层)微液滴稳定地进行PCR扩增反应，人们往往需要使用稳定性高的材料(如：玻璃)。然而，这种限制将会增加工艺的选择性及难度，导致加工成本增加。(d)在数字PCR扩增过程中，微液滴平铺成一层的状态很难维持。扩增过程涉及到温度循环(温度在4～96摄氏度范围内变化)，温度的变化将会诱导流动及气泡的产生，扰乱液滴平铺的状态，导致数字PCR检测的失败。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是提供一种核酸高灵敏检测的液滴微流控芯片。