[发明专利]一种牙类器官冻存方法

说明书

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种牙类器官冻存方法,获取供体类牙器官；包括类牙器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8‑12min，再将容器置于冷冻条件下保存12~36h后转移至液氮中保存；使用时将容器置于37‑40℃水浴中快速解冻复苏；取出类牙器官，用PBS缓冲液洗涤，再放入PBS缓冲液或生理盐水中浸泡待用等步骤。本发明中将发育中的器官进行冻存，冻存后能继续发育成成熟器官，且有着高的活性和发育能力；冻存方法操作简便，重复性好，并容易进行推广。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种牙类器官冻存方法。

背景技术

体外冻存技术目前已广泛应用于细胞研究领域，但目前对于器官培养的冻存研究尚无大量文献报导。牙齿的外层由牙本质、牙釉质和牙骨质等硬组织包绕，内部则为牙髓软组织，是一个特化的器官。对于这种兼具软硬组织的器官，体外冻存是具有挑战性和难度。

从发育学的角度看，器官发育是一个动态的整体，任何器官的发育都离不开周围的环境，而另一方面，器官本体周围的环境也在同时进行发育，随时产生变化，这也强调了发育的复杂性和发育学研究的难点。全牙的保存之所以困难，主要是因为牙体硬组织阻挡了冻存保护液向髓腔内渗透，牙髓的活力在冻存后通常难以保留，牙髓组织会发生不同程度的变性，坏死。牙齿外层硬质材料无法渗透营养液，也决定了牙胚不好增育。

比如对大鼠切牙进行冻存，其冠部2/3牙髓几乎全部丧失活力，而根尖1/3部分的牙髓可保存较高的活性。体外冻存人类三磨牙，结果也显示根尖1/3的牙髓成纤维细胞有较强的活力，根中1/3的细胞活力下降，冠髓则未见成纤维细胞。

目前关于牙再生研究主要有两种：1、基于发育学原理，通过诱导具有成牙潜能的上皮与间充质细胞，重组牙胚或牙胚类器官，使二者再相互诱导发育形成牙体组织；2、利用组织工程原理，在体外复合干细胞，生长因子与支架材料，分别构建牙体硬组织，牙周组织与牙髓组织，再组合构建组织工程牙。

牙胚重组和组织工程牙的构建都存在诸多限制：重组牙胚需要具有成牙能力的上皮或者间充质细胞来诱导重组体定向发育，但胚胎期的牙胚难以获取，几乎不可能实现，而胚胎干细胞，诱导多能干细胞的研究目前还不够成熟，难以对其精确地定向诱导。对于组织工程牙，成体干细胞的选取和诱导，生物支架材料的选择和制备，都还需要通过大量实验的摸索优化，距广泛临床应用尚还有一定距离。

自体牙移植相较上述两种方法来说，其在临床上已有使用，具有一定优势。预防性拔除智齿和因正畸需求拔除的牙齿均可作为供体牙来源。自体牙移植还可规避诸如免疫排斥、伦理等临床应用问题。但其适应范围相对受限，需要牙缺失患者自身同时具备合适的供体牙来源。有人为解决这个问题，尝试对牙齿在体外进行冻存，旨在拓宽其适应证，但保存后的牙齿活力难以维持,发育能力弱或失去。

因此，自体牙移植和牙再植术在临床上尚不甚成熟。

目前如何将冻存牙类作为一种医疗资源使用，且又能再发育，又具有高活性和发育能力，这是现在所需要的。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种牙类器官冻存方法，将发育中的器官进行冻存，冻存后能继续发育成成熟器官，且有着高的活性和发育能力；冻存方法操作简便，重复性好，并容易进行推广。

牙类器官：牙发育过程中一定时期的牙胚；或利用多能干细胞或成体干细胞，模拟体内牙发育模式，通过干细胞自组装和定向分化，体外三维培养形成具有一定结构和功能的牙胚类似物。

解决以上技术问题的一种类牙器官冻存方法，其特征在于：

(1)获取供体牙类器官；

(2)牙类器官放于装有培养基的容器中浸泡，静置8-12min，再将容器置于冷冻条件下保存12～36h后转移至液氮中保存；使冻存保护液渗透进入到硬组织包裹的牙乳头中，从而使牙乳头在复苏后保留了良好的活性，继续发育成为牙髓牙本质复合体。