[发明专利]一种遗传性出凝血的基因文库构建方法和试剂盒

权利要求书

1.一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)DNA质量标准：受试者样本的基因组DNA，经过核酸提取、质量检测后，要求基因组DNA符合相应的控制标准；

(2)目标区域扩增：利用上述(1)DNA及合成的5’端磷酸化修饰的相应引物组，对目标区域进行PCR扩增；

(3)测序标签连接：在DNA连接酶作用下利用上述步骤(2)的PCR产物连接高通量测序平台专用测序标签，测序标签含有区分样本的特异性标签序列；

(4)文库纯化：步骤(3)的产物中加入纯化磁珠后混匀纯化；

(5)产物洗脱及扩增：在上述步骤(4)中加入PCR扩增预混液，进行PCR扩增反应；

(6)扩增产物纯化：在上述步骤(5)的PCR产物中加入磁珠纯化即得文库；

(7)文库质检：使用Qubit荧光计对步骤(6)中文库进行定量质检。

2.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，上述步骤(1)中所述的DNA质控标准为，采用Qubit荧光计测量DNA浓度≥1ng/μL；DNA纯度：OD260/280＝1.8-2.0，OD260/230>2；DNA总起始量:2ng。

3.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中所述的目标区域包含以下基因的编码氨基酸的外显子区域及外显子上下游各20碱基区域：F5、F7、F8、F9、FGA、VWF、CYCS、TUBB1、MPL、ITGA2B、ITGB3、NBEAL2、MYH9、GP1BA、RBM8A、WAS、GATA1、SERPINC1。

4.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(2)中进行目标区域PCR扩增的引物组为两个独立的引物组，分别进行目标区域扩增，每个引物的扩增产物长度均在125-275bp。

5.如权利要求4所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，每个独立的引物组反应体系为5-10μL，2个引物组总反应体积为10-20μL；目标区域扩增反应体系按照下述体积比组成扩增体系PCR扩增预混液：引物组：DNA＝1:1:3；反应条件：99℃保持2min；然后进行16～19个循环，每个循环为99℃15s，60℃4～8min；最后保持在10℃不超过12h。

6.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中将步骤(2)得到的两个独立引物组扩增产物混合，加入连接酶、连接预混液、测序标签，其体积比为1:2:1；反应条件：22℃保持30min；72℃保持5～10min；最后保持在10℃不超过1h。

7.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述连接反应产物与纯化磁珠的体积比为1:1.5；步骤(6)中PCR产物与纯化磁珠的体积比为1:0.5:1.2。

8.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(5)中所述再扩增反应条件：98℃保持2min；然后进行5-10个循环，每个循环为98℃15s，64℃1min；最后保持在10℃不超过12h。

9.如权利要求1所述的一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，步骤(7)使用Qubit荧光剂进行文库定量质检：两个独立引物组的扩增产物均在125-275bp，结合Ion平台测序标签后，平均长度为275bp，18ng/mL为100pM。

10.一种遗传性出凝血的基因文库构建方法，其特征在于，包括权利要求1-9任意一项中所述的基因检测文库的建库试剂及引物组序列，所述引物序列SEQ ID NO 1至SEQ ID NO288。