[发明专利]一种用于验证特定DNA片段拷贝数变异的引物设计方法、引物、试剂盒、方法和系统

权利要求书

1.一种用于验证特定DNA片段拷贝数变异的引物设计方法，其特征在于，所述引物设计方法包括以下步骤：

针对已知存在杂合微小变异且可能存在杂合缺失拷贝数变异的待验证特定DNA片段，设计至少一对用于检测所述杂合微小变异的引物，其中设计的引物对中的一条引物位于微小变异的上游或者下游，另一条引物位于待验证缺失拷贝数变异区域，设计的引物对为用于验证特定DNA片段拷贝数变异的引物；

所述待验证特定DNA片段为CYP11B1基因，杂合微小变异位于CYP11B1基因第8号外显子c.1391_1393dup，所述杂合微小变异上游附近可能存在杂合缺失拷贝数变异；

用于验证特定DNA片段拷贝数变异的引物由巢式PCR扩增的外侧引物对和内侧引物对组成：

外侧引物对：

上游引物F1：5’-TACTTGGGATTGTGATGTG-3’，

下游引物R1：5’-AAACCACAGCACCCTTGCATGGCCA-3’；

内侧引物对：

上游引物F2：5’-TAAACAGCGTCACCCAGCAG-3’，

下游引物R2：5’-CTTAGCCTGGCAAACCCTGG-3’。

2.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于，所述待验证特定DNA片段中微小变异与缺失拷贝数变异区域的距离小于800bp。

3.根据权利要求1所述的引物设计方法，其特征在于，所述待验证特定DNA片段是经高通量测序检测出存在杂合微小变异且可能存在杂合缺失拷贝数变异的DNA片段。

4.一种非疾病诊断和治疗目的的用于验证特定DNA片段拷贝数变异的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）以包括已知存在杂合微小变异且可能存在杂合缺失拷贝数变异的待验证特定DNA片段的DNA样本为模板，采用用于验证CYP11B1基因拷贝数变异的引物进行扩增，将扩增得到的产物进行sanger测序；

（2）将步骤（1）得到的sanger测序结果与正常人对照序列进行比对；比对后验证结果如下：

若sanger测序结果显示所述待验证特定DNA片段中的微小变异为纯合微小变异，则该待验证特定DNA片段存在杂合缺失拷贝数变异，并且与微小变异位于不同的同源染色体上；

若sanger测序结果显示所述待验证特定DNA片段中的微小变异为杂合微小变异，则该待验证特定DNA片段不存在缺失拷贝数变异；

若sanger测序结果显示在所述待验证特定DNA片段中未测到微小变异，则该待验证特定DNA片段存在杂合缺失拷贝数变异，并且与微小变异位于同一同源染色体上；

所述待验证特定DNA片段为CYP11B1基因，杂合微小变异位于CYP11B1基因第8号外显子c.1391_1393dup，所述杂合微小变异上游附近可能存在杂合缺失拷贝数变异；

用于验证CYP11B1基因拷贝数变异的引物由巢式PCR扩增的外侧引物对和内侧引物对组成：

外侧引物对：

上游引物F1：5’-TACTTGGGATTGTGATGTG-3’，

下游引物R1：5’-AAACCACAGCACCCTTGCATGGCCA-3’；

内侧引物对：

上游引物F2：5’-TAAACAGCGTCACCCAGCAG-3’，

下游引物R2：5’-CTTAGCCTGGCAAACCCTGG-3’。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述待验证特定DNA片段与所述DNA样本中其他DNA序列的同源性大于等于80%。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述待验证特定DNA片段与所述DNA样本中其他DNA序列的同源性大于等于90%。

7.一种用于验证特定DNA片段拷贝数变异的系统，其特征在于，包括

基因扩增装置，所述基因扩增装置，用于扩增包括已知存在杂合微小变异且可能存在杂合缺失拷贝数变异的待验证特定DNA片段的DNA样本，所述扩增使用的引物为采用用于验证CYP11B1基因拷贝数变异的引物；

基因测序装置，所述基因测序装置与所述基因扩增装置相连，并且用于对所述扩增的产物进行sanger测序，以便获得待验证特定DNA片段中微小变异的sanger测序序列；

比对装置，所述比对装置与所述基因组测序装置相连，所述比对装置内预存有正常人参考序列信息，所述比对装置用于将得到的sanger测序序列与所述正常人参考序列信息进行比对，基于比对结果来得到由sanger测序结果确定的微小变异情况，然后结合待待验证特定DNA片段中存在杂合微小变异这个已知信息来验证待验证特定DNA片段中杂合缺失拷贝数变异的情况；若sanger测序结果显示所述待验证特定DNA片段中的微小变异为纯合微小变异，则该待验证特定DNA片段存在杂合缺失拷贝数变异，并且与微小变异位于不同的同源染色体上；若sanger测序结果显示所述待验证特定DNA片段中的微小变异为杂合微小变异，则该待验证特定DNA片段不存在缺失拷贝数变异；若sanger测序结果显示在所述待验证特定DNA片段中未测到微小变异，则该待验证特定DNA片段存在杂合缺失拷贝数变异，并且与微小变异位于同一同源染色体上；以及

结果输出装置，所述结果输出装置与所述比对装置相连，以便输出验证结果；

所述待验证特定DNA片段为CYP11B1基因，杂合微小变异位于CYP11B1基因第8号外显子c.1391_1393dup，所述杂合微小变异上游附近可能存在杂合缺失拷贝数变异；

用于验证CYP11B1基因拷贝数变异的引物由巢式PCR扩增的外侧引物对和内侧引物对组成：

外侧引物对：

上游引物F1：5’-TACTTGGGATTGTGATGTG-3’，

下游引物R1：5’-AAACCACAGCACCCTTGCATGGCCA-3’；

内侧引物对：

上游引物F2：5’-TAAACAGCGTCACCCAGCAG-3’，

下游引物R2：5’-CTTAGCCTGGCAAACCCTGG-3’。