[发明专利]一种新型脂肪酶及其制备与应用

说明书

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种耐碱性能提升的脂肪酶突变体及其制备与应用。通过分子生物学技术手段获得野生型的脂肪酶基因，利用易错PCR技术对大肠杆菌密码子优化后的野生型脂肪酶基因进行随机突变，得到脂肪酶突变体N157F，及其编码基因mpcl，重新构建重组载体，并实现了其在枯草芽孢杆菌WB600和毕赤酵母GS115中的高效表达，通过发酵、提取等技术获得碱耐受性进一步提高的脂肪酶。

技术领域：

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种耐碱性能提升的脂肪酶突变体及其制备与应用。

背景技术：

脂肪酶(Lipase,E.C.3.1.1.3)，全称为三酰基甘油酯基水解酶(triacylglyce-rolacylhydrolase)，隶属于羧基酯水解酶类，它能催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单脂，主要分布在动植物和微生物组织中。动物中的脂肪酶其含量及活性不高就会造成工业生产程度也不高。植物中的脂肪酶主要存在于油脂丰富的油料种子中，因为酶活力差异较大，所以对植物脂肪酶的研究也就相对较少。由于微生物种类多、繁殖快，拥有更为宽泛的反应pH值、反应温度和底物选择性，且微生物脂肪酶一般是胞外酶。因此，微生物脂肪酶是工业脂肪酶的重要来源。已有报道，产脂肪酶的微生物至少有65个属，其中细菌28个属，酵母菌10个属，其他真菌23个属以及放线菌4个。

总体而言，脂肪酶由于其分布广泛，其催化反应多样，且能在有机相体系中进行催化反应，脂肪酶的反应条件温和，对环境污染小，成本低廉，因此广泛应用于洗涤剂、制革、造纸、纺织、食品、药品、化工等领域。目前，微生物脂肪酶作为一种重要的工业酶，在传统工业和新型的产业中都有广泛的应用，一直是行业中的研究热点。与其他水解酶类相比，不同类型脂肪酶的应用严格受限于其活性、专一性、最适温度和pH值、温度和酸碱稳定性、溶剂耐受性等酶学性质，因此市场对酶制剂的各项性质和指标提出了更高的要求。微生物脂肪酶基因和蛋白相关资源信息虽丰富，但适合食品、药品和能源等工业应用的脂肪酶制剂品种依然较少，所以筛选到合适的脂肪酶及其编码基因是脂肪酶研发的重要基础。目前，已发现的脂肪酶中有一些表现出了一定的碱耐受性，但仍需进一步提升其耐碱性能，以适应各行业的需要。

定向进化属于蛋白质的非理性设计，属于蛋白质工程的范畴。定向进化是指模拟自然选择的进化机制，通过分子生物学手段在体外快速建立含大量目的蛋白编码基因的突变体文库，并通过高通量的定向筛选方法，快速得到符合人类应用价值的蛋白突变体。定向进化与自然进化都遵循试错法的策略，通过不断的实验尝试获得符合预期的突变体。由于定向进化不需要获得蛋白的高级结构以及催化位点等结构，因此只须对蛋白氨基酸序列做随机突变，这是蛋白质工程的重要研究手段。定向进化的核心步骤主要包括两部分，即构建具有多样性的突变体文库和高通量的筛选方法。常用的包括：易错PCR、DNA改组、交错延伸过程、随机引导重组、截断状模板重组延伸等。与此不同，需要事先了解蛋白质的空间结构、活性位点、催化机制等因素，并根据这些因素有的放矢做对其DNA进行改造的是定点突变，即理性设计。

枯草芽孢杆属于革兰氏阳性菌，无致病性，不产生任何内毒素，作为一种安全、高效、多功能和极具开发潜力的微生物菌种已广泛应用于工业、农业、医药、卫生、食品、畜牧业、水产及科研领域。枯草芽孢杆菌并且属于人体肠道菌，能促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。此外枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的蛋白基因。在微生物遗传学领域，芽孢杆菌属背景研究的也十分清楚，密码子偏爱性不明显、发酵简单、生长迅速、对培养基无特殊要求等优点。它与常用的大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可将目的基因表达的产物分泌到胞外，从而降低进一步收集、分离、纯化基因表达产物的成本和工作量。