[发明专利]基于N-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法

说明书

本发明属于代谢组学及生命分析化学技术领域，具体为基于N‑烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。本发明步骤包括：氨基代谢物标准溶液的配制；氨基代谢物的烷基化反应；采用UHPLC‑MS/MS对多种烷基化氨基代谢物的定量检测分析。本发明采用还原胺化法，利用NaBH₃CN/NaBD₃CN和五种醛（乙醛，丙醛，丁醛，戊醛和己醛）对代谢物的氨基烷基化（乙基化，丙基化，丁基化，戊基化，己基化）修饰，不仅改善了氨基代谢物在色谱反相柱上保留，提高其质谱离子化效率，还可实现更为精准的同位素内标定量测量。本发明衍生化条件温和、反应效率高、易于淬灭且后处理简单，具有较高检测灵敏度。

技术领域

本发明属于人体氨基代谢物测量技术领域，具体涉及基于N-烷基化衍生方法的多种氨基代谢物同步定量分析方法。

背景技术

含有氨基的代谢物(氨基代谢物)是一类重要的生物代谢物，涵盖数十个重要的代谢通路。它们在维持氧化还原平衡、蛋白质与核酸及神经递质的合成、能量代谢等多个方面具有重要功能。因此其含量变化与糖尿病、肝病等多种疾病的发生发展机制密切相关。譬如，支链氨基酸在糖尿病及患有严重肝脏疾病的病人与正常人体液中含量具有明显差异；多巴胺含量下降与帕金森病直接相关；5-羟色胺对记忆、抑郁和焦虑型障碍有关键作用等。因而，氨基代谢物的高通量同步定量分析对疾病的精准诊疗具有重要意义。

由于生物基质的复杂性以及氨基代谢物较多的种类和较大的浓度动态范围，目前基于UHPLC-MS的氨基代谢物定量分析存在以下难点：第一，这类代谢物大多极性强，不适用于反相柱分离，而亲水色谱的重现性较差并需要较长的柱平衡时间；第二，部分代谢物的离子化效率低，灵敏度不高；第三，由于生物基质的复杂，通过外标法很难实现准确定量，而同位素内标价格昂贵且不易获得。

为了解决以上问题，需通过衍生化增加氨基代谢物的疏水性，且衍生化试剂需反应条件温和，特异性强，效率高，易淬灭，后处理简单，可引入稳定同位素，从而通过色谱质谱技术实现准确内标定量。

发明内容

本发明的目的是提供一种反应条件温和，特异性强，效率高，易淬灭，后处理简单的多种氨基代谢物同步定量分析方法。

本发明提供的多种氨基代谢物同步定量分析方法，是基于氨基代谢物的一类N-烷基化柱前衍生化方法(简称“N-烷基化法”)，然后通过UHPLC-MS/MS方法同时对多种人体氨基代谢物进行高灵敏的内标定量分析。本发明方法易操作且检测灵敏度高。

本发明提供的基于N-烷基化法的多种氨基代谢物同步定量分析方法，具体步骤如下：

(1)氨基代谢物标准溶液的配制：取氨基代谢物标品，用体积比50-70％的甲醇水溶液配制成浓度为10-600μM的标准溶液；

(2)氨基代谢物的衍生化反应：在含N-乙基马来酰亚胺(NEM，其浓度为2-5倍氨基代谢物浓度)的磷酸缓冲液中(缓冲液浓度为0.1-0.3M，pH为7-8)，加入氨基代谢物标准溶液，20-30℃反应1-20min，然后加入4-叔丁基苯硫酚(tBBT，其浓度为5-10倍NEM浓度)，20-30℃反应2-10min，再加入含三(2-羧乙基)膦(TCEP，其浓度为5-20倍氨基代谢物浓度)和抗坏血酸(Vc，其浓度为5-20倍氨基代谢物浓度)的醋酸缓冲液(保证反应液中浓度为0.1-0.5M，pH为5-7)，涡旋混匀10-20min，再加入NaBH₃CN或者NaBD₃CN(其浓度为100-200倍氨基代谢物浓度)，涡旋混匀，再加入醛溶液(这里醛为乙醛、丙醛、丁醛、戊醛或者己醛，其浓度为250-500倍氨基代谢物浓度)，25-37℃反应12-24h；然后用盐酸调节反应液pH至2-3，淬灭反应，稀释后加入内标(图1为衍生化反应流程)；

(3)烷基化氨基代谢物的检测：采用UHPLC-MS/MS(超高效液相色谱-串联质谱)进行测定。