[发明专利]大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452、其编码的蛋白质与应用

说明书

大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452、其编码的蛋白质与应用，涉及分子生物学、基因工程领域，本发明通过基因筛选，异源表达，酶活检测等技术对一个药用植物大戟的CYP450进行了功能鉴定，该酶可以在蓖麻烯及其衍生物的9位加一个羟基，依据细胞色素P450基因命名法则命名为CYP71D452。本发明提供的CYP71D452基因可应用于通过合成生物学或代谢工程技术异源合成和生产二萜类化合物，也可用于调节植物二萜类化合物的生物合成，及通过生物技术提高大戟中活性二萜类化合物的含量。同时该基因也可以用于大戟的杂交育种和优良品种选育。

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程领域，具体地涉及一种大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452、其编码的蛋白质与应用。

背景技术

药用植物次生代谢产物是其生物活性成分的主要来源。近年来，测序技术的发展为药用植物生物活性成分合成相关基因的发掘与鉴定奠定了前期研究基础。生物活性成分合成相关基因的克隆及功能验证也为代谢工程和合成生物学研究提供必要的生物元件，为药用植物的选种育种及品质改良提供指导。

京大戟是药用植物大戟(Euphorbia pekinensis Rupr)的干燥根，在临床上主要用于治疗水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气逆咳喘、二便不利、痈肿疮毒、瘰疬痰核等病症，但由于其刺激性，限制了其大量的应用。大量的研究表明二萜类化合物是京大戟的主要活性成分，具有显著的抗肿瘤活性。目前已经从京大戟中分离了大量的二萜类化合物，如casbane烷型二萜京大戟素(euphpekinensin)，异京大戟素，pekinenal，pekinenin A、B、C、D、E、F、G，月腺大戟素B；千金二萜烷(ingol)型二萜3,12-O-diacetyl-7-O-benzoyl-8-methoxyingol，ingol-12-acetate，ingol等；西松烷(cembrane)型二萜(－)-(1S)-15-hydroxy-18-carboxycembrene等。其中casbane烷型二萜和千金二萜烷型二萜都以蓖麻烯为中间代谢物通过各种不同的CYP450酶催化衍生而来。

细胞色素P450(cytochromeP450,简称CYP450)是血红蛋白大家族中极其重要的成员，催化有机化合物的氧化还原反应是它重要的效用，CYP450是单加氧酶中的一种，所以又称做单加氧蛋白P450。CYP450在自然界以单体或二聚体的形式普遍存在，参与植物中多种结构产物的修饰，特别是多结构类型的萜类化合物的合成。在千金二萜烷型二萜的生物合成过程中需要在蓖麻烯5位和9位碳上先发生氧化，而这两个部位的氧化需要CYP71D家族和CYP726A家族的CYP450酶的参与。在续随子中CYP71D445催化9位碳上的氧化，CYP726A27催化5位碳上的氧化，这两个酶在乙醇脱氢酶同时存在的情况下可以将casbane烷型结构转变为千金二萜烷型结构，在此基础上形成多种骨架和活性的二萜。

发明内容

作为本发明的一个方面，提供了一个参与大戟活性二萜类化合物合成途径的细胞色素P450基因CYP71D452，其编码的蛋白能在蓖麻烯及其衍生物的9位加一个羟基，其核苷酸序列为下列序列之一：

(1)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经添加、替换、插入或缺失一个或几个核苷酸而成的同源序列；

(3)如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列的等位基因或所述等位基因衍生物的核苷酸序列。

本发明还提供了一种表达载体，其含有上述大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452的全序列或部分片段。

本发明还提供了一种转基因细胞系，其含有上述大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452的全序列或部分片段。

本发明还提供了一种工程菌，其含有上述大戟二萜类化合物合成基因CYP71D452的全序列或部分片段。