[发明专利]一种DNA聚合酶、重组载体及它们的制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于多重PCR靶向测序的高保真DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶的重组载体及它们的制备方法和应用。本发明的DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；编码所述DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。同时本发明提供一种包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列的重组载体以及上述DNA聚合酶、重组载体的制备方法和应用方法。本发明的DNA聚合酶、重组载体具有超强的扩增效率和扩增保真性，能够适用于多引物对数的多重PCR技术。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶编码序列的重组载体及它们的制备方法和应用。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)，因为其方便、快捷、准确地大规模复制目的基因片段的能力，在生命科学研究与相关领域，如医学检测、感染性疾病检测、法医学检测分子进化等，成为了无法取代的技术手段。

多重PCR(multiplex PCR)是在常规PCR基础上进行升级改进的技术手段。对比常规PCR，多重PCR是在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段，在相同的单位时间内获得更多的扩增产物，大大提高了扩增效率，同时降低了时间与试剂成本。

作为多重PCR的核心工具，DNA聚合酶在扩增反应中的作用很关键。DNA聚合酶性能会直接影响扩增效率、灵敏度、保真性等。市面上高保真DNA聚合酶，相比于非高保真酶如Taq DNA聚合酶，具有3'-5'外切酶的即时校正活性，可以即时识别并切除错配核苷酸，因而能够最大程度的避免DNA复制中产生的错误，被广泛应用于分子诊断、大规模平行测序等高灵敏度检测应用中；然而正是由于其校正活性，通常的高保真DNA聚合酶扩增效率较低，碱基延伸速度与扩增片段的长度低于普通的Taq DNA聚合酶。

目前靶向测序主要有两种方式来富集目标序列，一是多重PCR富集，二是液相杂交富集。多重PCR富集因为能够适应更低的上样要求与简单方便的操作，而逐渐在靶向测序中占得上风，成为愈来愈多靶向测序的优选方法。市面上常见的高保真DNA聚合酶如pfu DNA聚合酶等，扩增效率较差，只能满足于引物对数少于20对的多重PCR反应，无法满足大规模平行测序NGS中检测的多引物对要求，限制了多重PCR在靶向测序的使用和推广。

发明内容

鉴于此，有必要针对上述问题提供一种适用于多重PCR靶向测序的高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合酶、含所述DNA聚合酶编码序列的重组载体及它们的制备方法和应用。本发明的高保真DNA聚合酶，具有超强的扩增效率和扩增保真性，能够适用于多引物对数的多重PCR。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种高保真DNA聚合酶，命名为Mup DNA聚合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

所述Mup DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Mup DNA聚合酶具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。

一种编码所述Mup DNA聚合酶的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。SEQID NO:2所示序列中，Linker序列为“ggcggcggcggcagcggcggcggcggcagcggcggcggcggcagc”；His标签序列为“catcatcatcatcatcat”。Linker之前的序列为优化后的Pfu DNA聚合酶DNA序列，Linker与His标签之间的为优化后的Sso7d序列。

一种重组载体，其含有编码Mup DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子具有如SEQ IDNO:2所示的核苷酸序列。

优选地，上述的重组载体为含有T7启动子、lac操纵子的重组载体。

一种高保真DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：