[发明专利]一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法

权利要求书

1.一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

预处理：将接穗浸入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于组织培养室进行水培处理；将水培处理后的接穗切取茎段，去除叶柄，乙醇消毒，转入头孢噻肟溶液和青霉素G钠盐溶液的混合溶液中，置于摇床振荡过夜预培养；

接种：将预培养后的接穗茎段用乙醇消毒、升汞液消毒及无菌水冲洗，切除接穗茎段两端后进行接种培养。

2.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述接穗为含有饱满芽或腋芽的桑树枝条；所述水培处理采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述水培的时间为48h。

3.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述预培养采用的所述头孢噻肟溶液的浓度为500mg/L，所述青霉素G钠盐溶液的浓度为400mg/L，所述头孢噻肟溶液与所述青霉素G钠盐溶液混合体积比为1:1，所述摇床振荡的时间为12h。

4.如权利要求1所述的一种抑制桑树组织培养内生菌污染的方法，其特征在于，所述接种过程中所述乙醇的体积浓度为70％-75％，所述乙醇的消毒时间为10-20s；所述升汞液的质量浓度为0.1％，所述升汞液的消毒时间为6-10min。

5.一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述方法包括接穗预处理过程、配制培养基过程和桑树组织培养再生体系培养过程；所述桑树组织培养再生体系培养过程包括桑树冬芽或腋芽启动培养过程、桑树再生体系的继代培养过程和桑树再生体系的生根培养过程；其中，所述预处理过程为权利要求1-4任一项所述的预处理过程。

6.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述配制培养基过程具体为：以MS和WPM为基本培养基，附加蔗糖40g/L，琼脂7.5g/L，pH为5.8；培养条件为温度23-27℃，光照强度2000lx，光照时间10h/d，附加聚乙烯吡咯烷酮2.0g/L；

桑树芽启动和分化最佳培养基：MS+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；

桑树腋芽启动和分化最佳培养基：WPM+6-BA 2.00mg/L+2,4-D 0.10mg/L；

桑树叶片诱导愈伤组织最佳培养基：MS+6-BA 1.00mg/L+2,4-D 0.80mg/L；

桑树叶片愈伤组织不定芽分化的培养基：MS+6-BA3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；

继代培养基：M S+6-BA 3.00mg/L+IAA 0.10mg/L；

生根培养基：1/2MS+NAA 0.20mg/L。

7.如权利要求5所述的一种桑树组织培养方法，其特征在于，所述桑树冬芽或腋芽启动培养过程具体为：

(1)接种前将培养基及接种用具放入超净工作台台面，用超净工作台紫外灯照射30min，关闭紫外灯，通风10min后，再打开日关灯；用75％酒精棉球擦拭超净工作台台面，点燃酒精灯，镊子和解剖刀在酒精灯火焰上炽烧片刻，待冷却后进行外植体的消毒和接种；

(2)将预处理过的桑树外植体在超净台内用无菌水冲洗4次，沥干水后置于灭菌处理过的碟子中，用灼烧后的镊子和解剖刀将经预处理过的接穗茎段置于超净工作台上，用75％乙醇消毒15s，0.1％升汞消毒8min，无菌水冲洗3次，将茎段两端切去、接种，以上操作均需在酒精灯火焰旁进行；

(3)在酒精灯旁打开培养基瓶盖，用无菌镊子将桑树外植体接种在培养基中，每瓶接种3个，封口后熄灭酒精灯；

(4)将接种有桑树外植体的培养瓶置于培养室内进行培养。