[发明专利]一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：

1)重组质粒构建：根据人的端粒酶的全基因序列设计一对扩增hTERT基因PCR特异性引物，将扩增的hTERT基因重组转载到重组质粒pLOV-CMV上，获得重组质粒pLOV-CMV-hTERT；

2)慢病毒样颗粒的制备：对步骤1)重组质粒pLOV-CMV-hTERT用试剂盒进行纯化得无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT，将无内毒素的重组质粒pLOV-CMV-hTERT、包装质粒pSPAX2以及外膜质粒pMD2.G质粒用转染试剂共转染到293T细胞中，转染30h收集细胞上清液，并置于-80℃保存；

3)表达hTERT基因的细胞系构建和筛选：用步骤2)中慢病毒样颗粒的细胞培养上清液感染绵羊睾丸细胞，用嘌呤霉素培养基进行筛选；

4)hTERT基因表达及其mRNA转录水平检测：提取步骤3)筛选后细胞系的总DNA和总RNA，用PCR检测hTERT基因表达，用RT-PCR方法检测hTERT基因的mRNA转录水平；

5)hETRT蛋白表达检测：取步骤3)细胞系的细胞进行Western blotting检测和间接免疫荧光检测，以鉴定hTERT蛋白的表达。

2.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：所述hTERT基因PCR特异性引物的序列如下：

hTERT-Nhe Ⅰ-F：5’-CTAGCTAGCTAGATGCCGCGCGCTCCCCGCT-3’，

hTERT-Not Ⅰ-R：5’-TTGCGGCCGCTCAGTCCAGGATGGTCTTGAA-3’。

3.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤3)中嘌呤霉素培养基的嘌呤霉素浓度为0.75μg/mL。

4.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤5)中Western blot检测中，一抗为Flag标签单抗，β-actin为内参蛋白，二抗为辣根酶标记的抗鼠二抗；间接免疫荧光检测中，一抗为hTERT多克隆抗体，二抗为Alexa Fluor594 Goat Anti-rabbit IgG。

5.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：所述hTERT基因的基因序列如SEQ ID No.1所示。

6.根据权利要求1所述的一种绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系的构建方法，其特征在于：所述hTERT基因的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

7.一种采用权利要求1-6任一项绵羊羊睾丸细胞永生化细胞系构建方法构建的细胞系在病毒感染实验中的应用。