[发明专利]一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法

权利要求书

1.一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，该方法的具体步骤如下：

（1）母种的活化扩繁

用接种铲挖取保存在PDA斜面上的大小为0.5cm²的灵芝母种，接种到新鲜的PDA斜面试管中，于28℃恒温培养5d，用直径为1cm的打孔器将已活化的灵芝母种接种于PDA平板培养基中央，于28℃恒温培养6~7d，待菌丝长满平板后接种；

（2）摇瓶菌种的制备

用直径1cm的打孔器，从平板上取2~3个大小相同的菌丝块接入装有液体培养基的锥形瓶中，装液量为400mL/1L，于29~31℃、130~150r/min条件下恒温振荡培养3~4d；

（3）种子液的制备

将液体培养基按照60~70%的装液量装入种子罐中进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，等到培养基温度冷却至30℃左右时，将上述摇瓶菌种接入种子罐，接种量为6~10%，培养温度为29~31℃，转速为130~150r/min，培养5~6d即可获得种子液；

（4）一氧化氮和乙烯协同诱导处理

将发酵培养基按照60~70%的装液量装入发酵罐①中进行高压蒸汽灭菌，灭菌结束后，等到培养基冷却后，将上述种子液接入发酵罐①，接种量为8~12%，培养温度为29~31℃，转速为110~130r/min，向发酵罐①中先后通入一氧化氮和乙烯高纯气体，进行协同诱导处理8h；

（5）半连续液体培养

a）待协同诱导处理结束后，向发酵罐①中通入净化空气，通气量为0.5~0.7（V/V·min），培养温度和转速不变，培养40h后将转速调整为130~150r/min，通气量调整为1.0~1.2（V/V·min），在此条件下培养18h，然后放出部分体积的发酵液到经过空消灭菌处理的发酵罐②中，再补加相同体积的发酵培养基；

b）发酵罐②中同时也补加相同体积的发酵培养基，培养温度为29~31℃，转速为130~150r/min，通气量为1.0~1.2（V/V·min），发酵液pH调整为4.4~4.6；

c）发酵罐①补加发酵培养基后，在与发酵罐②相同的培养条件下继续培养48h，然后重复放出发酵液到发酵罐②，两个发酵罐补加发酵培养基继续培养48h的操作，如此重复进行3个周期；

d）3个周期结束后，将两个发酵罐的转速调整为110~130r/min，通气量调整为0.5~0.7（V/V·min），培养温度保持不变，培养36h后结束培养，放罐。

2.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（2）和步骤（3）中，液体培养基的成分为：葡萄糖20~25g/L，玉米粉11~15g/L，酵母浸粉1.8~2.2g/L，干酪素3.7~4.3g/L，油菜秸秆粉2.1~2.3g/L，羧甲基纤维素钠3.0~4.0g/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄ 0.9~1.1g/L，胡萝卜汁26~34ml/L，蚯蚓干粉4.4~5.0g/L，ZnSO₄0.07~0.11g/L，四甲基戊二酸 5.4~5.8mg/L，松针提取液12~15ml/L，硬脂酸33~39mg/L，pH调节为5.2~5.4。

3.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（3）和步骤（4）中，高压蒸汽灭菌的条件为温度121-123℃，压力0.11-0.13MPa，灭菌时间40-50min。

4.根据权利要求1所述的一种半连续液体培养高效生产灵芝多糖的方法，其特征在于，所述步骤（4）中，发酵培养基的成分为：玉米粉24~28g/L，麦麸15~19g/L，木质素8.5~9.3g/L，酵母破碎液15~20ml/L，椰糠粉3.8~4.4g/L，大豆粉5.5~6.5g/L，羧甲基纤维素钠2.6~3.0g/L，三七药渣5.9~6.5g/L，穿心莲药渣3.3~3.9g/L，茯苓药渣5.2~5.8g/L，松针提取液12~15ml/L，KH₂PO₄ 1.8~2.2g/L，MgSO₄ 0.9~1.1g/L，硝酸镧13~15mg/L，有机硅消泡剂30~40mg/L，初始pH调节为5.2~5.4。