[发明专利]一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法

权利要求书

1.一种器官芯片，其特征在于：该芯片主要由4层结构粘合封接而成，自上而下依次包括PDMS上层(1)，PDMS贯穿孔层(2)，聚碳酸酯膜层(3)，PDMS底层(4)；其中，所述PDMS上层(1)与PDMS贯穿孔层(2)封接相连；PDMS贯穿孔层(2)与聚碳酸酯膜层(3)通过PDMS胶体粘合连接，聚碳酸酯膜层(3)与PDMS底层(4)封接相连；

所述PDMS上层(1)包含细胞入口池(5)，上层培养基灌流室(6)、废液池(7)和上层灌流通道(14)；所述上层培养基灌流室(6)上端与细胞入口池(5)相连，下端与废液池(7)相连；

所述PDMS贯穿孔层(2)上设有细胞培养室(8)，PDMS贯穿孔层(2)上的贯穿孔与聚碳酸酯膜层(3)形成细胞培养小室(13)，细胞培养室(8)底部设有细胞培养室底(9)；所述细胞培养室(8)与细胞培养室底(9)通过PDMS粘合；

所述PDMS底层(4)包括下层培养基入口池(10)，下层培养基灌流室(11)、下层废液池(12)和下层灌流通道(15)；所述下层培养基灌流室(11)上端与下层培养基入口池(10)相连，下端与下层废液池(12)相连；

所述PDMS贯穿孔层(2)和聚碳酸酯膜层(3)多孔结构，实现上下层营养物和代谢产物的物质交换。

2.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述细胞培养小室(13)的个数为100～200个。

3.根据权利要求1所述的器官芯片，其特征在于：所述器官芯片上层灌流通道(14)和下层灌流通道(15)高度为300-500μm；所述细胞培养小室(13)半径为200-300μm，高度为250-400μm；PDMS贯穿孔膜(2)厚度为300μm，贯穿孔直径500μm；聚碳酸脂膜(3)厚度4-8nm，孔径4nm。

4.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述细胞培养小室(13)可进行编码，对单个干细胞来源的拟胚体进行原位诱导，并对发育过程，病理生理改变进行原位追踪观察。

5.根据权利要求1所述的多器官芯片，其特征在于：所述上层灌流通道(14)和下层灌流通道(15)可同时添加流体，实现良好的物质交换。

6.一种基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于采用了权利要求1和2中任一种的芯片，具体步骤如下：

(1)将hiPSCs细胞悬液由细胞入口池(5)注入芯片上，静置10min将培养室外散在细胞冲出，过夜培养后形成拟胚体，灌注诱导培养基，开始胰岛类器官诱导；

(2)人源诱导多能干细胞形成的拟胚体向胰岛类器官待诱导过程结束后，进行细胞死活染色实验验证细胞活性，蛋白及基因水平上鉴定胰岛的细胞种类，胰岛β细胞的成熟度，胰岛的内分泌功能，胰岛内分泌量及分泌时效性检测用以检测胰岛分泌功能。

7.根据权利要求6所述的基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于：所述细胞为人来源的多能干细胞。

8.根据权利要求7所述的基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于：所述人来源的多能干细胞为人胚胎干细胞hESCs、人诱导多能干细胞hiPSCs。

9.根据权利要求6所述的基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于：所述步骤(2)检测胰岛分泌功能之前需要用含20-30mM葡萄糖的KRBH缓冲液处理。

10.根据权利要求6所述的基于器官芯片的人胰岛类器官模型构建方法，其特征在于：所述诱导培养基具体如下：

第一阶段内胚层诱导：DMEM/F12基础培养基加0.2％BSA，50ng/ml activin A，3μMCHIR99021，2mM LiCl处理一天；之后用DMEM/F12基础培养基加0.2％BSA，1％B27，和50ng/ml activin A处理4天；

第二阶段胰向内胚层诱导：DMEM基础培养基加0.5％B27，2μM retinoic acid，2μMdorsomorphin，10μM SB431542，5ng/ml bFGF和250nm SANT-1，维持6天；

第三阶段向内分泌前体细胞诱导：DMEM基础培养基加0.5％B27s，50μg/ml ascorbicacid，2μM dorsomorphin，10μM SB431542和10μM DAPT，维持4天；

第四阶段向内分泌细胞诱导：CMRL 1066基础培养基加0.5％B27 supplement，0.5％penicillin–streptomycin，25mM glucose，2μM dorsomorphin，10μM SB431542，10mMnicotinamide和50μg/ml ascorbic acid，维持8天。