[发明专利]一种FTL敲低的人前列腺癌细胞株

说明书

本发明提供一种慢病毒感染人前列腺癌细胞株（PC‑3）敲除内源性基因，并成功建立稳筛细胞株。具体是利用FTL‑shRNA慢病毒感染PC‑3细胞株沉默FTL（铁蛋白轻链）表达，成功建立FTL敲低PC‑3细胞株。本发明通过研究证实FTL敲低PC‑3细胞株可稳定沉默FTL表达并传代。与阴性对照相比，敲低FTL后的PC‑3细胞株中FTL蛋白表达水平显著下降，细胞增殖能力和迁移能力显著增强。

技术领域

本发明涉及慢病毒感染人前列腺癌细胞株（PC-3）敲除内源性基因，并成功建立稳筛细胞株。具体是利用FTL- shRNA慢病毒感染PC-3细胞株沉默FTL（铁蛋白轻链）表达，成功建立FTL敲低PC-3细胞株。

背景技术

前列腺癌在西方国家男性高发的恶性肿瘤中，其死亡率高，居癌症死亡率的第二位，仅次于肺癌，近年来，随着人们生活方式的改变、人口的老龄化以及诊断水平的不断提升，我国前列腺癌的发病率呈明显上升趋势，成为严重危害我国男性身体健康的重要疾病之一。自20世纪90年代起，前列腺癌的实验研究在我国受到重视并迅速开展，然而人们对雄激素非依赖阶段前列腺癌及晚期前列腺癌的相关发病机制知之甚少，目前尚无有效的治疗方法，当前的研究仍然处于摸索阶段，还需要通过大量的体内外实验进行深入的探索。

铁蛋白主要存在于肝脏、脾脏和大脑的锥体外侧束的细胞核中，是铁在体内较为稳定的贮存形式。由功能不同的亚型：铁蛋白轻链（FTL）组成和铁蛋白重链（FTH）。FTL缺乏酶活性，即L亚型，相对分子质量为19000；FTH具有酶活性，即H亚型，相对分子质量 21000，可以将二价铁氧化成三价铁。铁蛋白参与多种疾病过程，目前大量临床和流行病学研究发现，体内铁蛋白储存量增高可能与罹患肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、胃肠道肿瘤、胰腺癌、乳腺癌有关，特别是当肝癌AFP测定值较低时，可测定铁蛋白浓度作为补充，以提高诊断效率。在多数肿瘤组织中，铁蛋白水平高于正常组织。

肿瘤基因治疗领域的新技术—RNA干扰（RNA interference，RNAi），是由双链RNA引发的转录后基因沉默现象（post-transcriptional gene silencing，PTGS），因其抑制效果确切、高特异性、高效性等特点而被广泛应用。以病毒载体形式表达的短发夹RNA（shorthairpin RNA，shRNA），通常是利用RNA聚合酶Ⅲ启动子（人或鼠U6或人H1启动子）转录下游反向重复DNA序列，形成小发夹结构，被Dicer等酶识别而切割成小干扰RNA（smallinterfering RNA，siRNA），进而稳定而特异地沉默基因，是发挥RNAi的有效方式。RNAi是研究基因功能、基因治疗的重要工具,目前已应用于恶性肿瘤、病毒感染性疾病基因治疗的研究。与腺病毒、逆转录病毒等其它病毒载体系统相比，慢病毒(Lentivirus)不仅能转导分裂细胞，还能转导非分裂期细胞，将外源性基因整合到靶细胞的基因组当中，从而实现对靶细胞中的目的基因稳定、持续的沉默。选用慢病毒做为载体系统来研究RNAi对细胞中基因的干扰过程具有巨大的潜力和明显的优势。

PC-3细胞株是从前列腺癌骨转移肿瘤中分离出来的细胞株，分化程度低，为雄激素非依赖性前列腺癌细胞，不含有内源性的雄激素受体，具有中等强度的转移潜能，被广泛于雄激素抵抗型的前列腺癌的研究。

近年来针对铁蛋白研究较多的肿瘤主要为卵巢癌、乳腺癌及肝癌，对前列腺癌中的研究尚且不足。因此，我们利用RNAi技术用FTL重组表达载体感染PC-3细胞建立FTL敲低的PC-3细胞模型，为研究FTL在前列腺癌早期诊断和基因治疗中应用提供了有力的实验材料。

发明内容