[发明专利]用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞

权利要求书

1.从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有下列组分的PBS缓冲液：0.1~0.3%胶原酶II、0.1~0.2%胶原酶IV、0.05~0.15%脱氧核糖核酸酶I、0.02~0.05%谷氨酸钠和0.01~0.05%海藻酸铵。

2.根据权利要求1的消化酶组合物，其特征在于，该消化酶组合物是含有下列组分的PBS缓冲液：0.2%胶原酶II、0.15%胶原酶IV、0.1%脱氧核糖核酸酶I、0.03%谷氨酸钠和0.025%海藻酸铵。

3.从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将胎盘浸泡于75%酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；

(3)将血管剪碎成1~2mm³碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；

(4)加权利要求1或2所述消化酶组合物消化；

(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；

(6)离心得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心，得到原始的P0代胎盘间充质干细胞，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80%以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞。

4.根据权利要求3的方法，其还包括如下步骤：

(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和检测；

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(11)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

5.根据权利要求3的方法，其中步骤(4)中加消化酶组合物消化0.5~2h。

6.根据权利要求3的方法，在步骤(6)中所述离心是以1000~2000rpm离心3~7min。

7.根据权利要求3的方法，在步骤(7)中接种密度为0.5~2x10⁵/cm²。

8.根据权利要求3的方法，在步骤(7)中，所述完全培养基其组成为：DMEM-F12+15% FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。

9.根据权利要求3的方法，在步骤(7)中，所述培养是在37℃、5% CO₂培养箱中进行培养。

10.根据权利要求4的方法，在步骤(9)中，进行细胞活性检测，其是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

11.根据权利要求4的方法，在步骤(9)中，进行细胞污染检测，其是利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。

12.根据权利要求4的方法，在步骤(9)中，进行遗传病检测，其是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。