[发明专利]鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品

说明书

本发明公开了鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品。本发明将鸡胚成纤维细胞细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；本发明进一步提供了一种制备鸡马立克氏病病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将所述适应无血清培养基呈悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的细胞接种鸡马立克氏病病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将病毒液离心；将沉淀细胞裂解、过滤、冷冻干燥，即得。本发明制备方法所制备的活疫苗安全性好，具有良好的免疫保护效力；有效降低了污染风险和生产成本，缩短了疫苗的生产时间，便于进行扩大生产规模。

技术领域

本发明涉及鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备方法及其产品，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备鸡马立克氏病病毒活疫苗的方法以及得到的鸡马立克氏病病毒活疫苗产品，属于鸡马立克氏病病毒活疫苗活疫苗的制备领域。

背景技术

马立克氏病(MD)是由疱疹病毒科细胞结合性(CA)马立克氏病病毒(MDV)引起鸡淋巴组织增生性肿瘤的一种高度接触性传染病。随着养鸡业的集约化程度的提高，该病带来的危害也在日益增大，防治不当将引起鸡群死亡、生产性能下降或产品质量降低，同时还能因其严重的免疫抑制作用而减弱其它疫苗的预防效果。因此马立克氏病的预防成为养鸡业的重中之重。MD是目前唯一能用疫苗进行预防的鸡肿瘤病。对于MD预防和控制，疫苗的使用是目前以及将来唯一的预防或控制途径。

DF-1细胞起源于鸡胚成纤维细胞，现已经成为一种成熟的传代细胞系。DF-1细胞体外培养具有很强的增殖能力，其细胞的密度能够超过CEF4倍以上。DF-1细胞是逆转录酶阴性、非致瘤性的细胞。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。

传统的DF-1培养大多采用血清贴壁的方式，该培养方式工艺复杂，占地面积大，需大量人工操作并且在培养过程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原体等污染的可能性，而且不同批次间的血清差异也会导致产品质量难以控制，同时也加大了下游分离纯化的难度。与血清贴壁培养技术相比，无血清悬浮培养技术无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，降低了污染风险和生产成本，缩短了生产时间。由于无血清悬浮培养技术不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。因此，无血清悬浮培养技术是细胞工业化生产疫苗的必然趋势。

因此，将DF-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备，对于降低鸡马立克氏病毒活疫苗的生产成本和污染风险、进行规模化生产等均具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；

本发明的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(DF-1细胞)制备鸡马立克氏病病毒活疫苗，该制备方法采用悬浮培养技术降低鸡马立克氏病病毒活疫苗的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明将传代鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为DF-1-XF。